Bahan mimiti: RNA
Quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR) nyaéta métode ékspérimén anu digunakeun dina ékspérimén PCR ngagunakeun RNA salaku bahan awal.Dina metode ieu, total RNA atawa messenger RNA (mRNA) mimiti ditranskripsi jadi DNA komplementer (cDNA) ku reverse transcriptase.Salajengna, réaksi qPCR dilakukeun nganggo cDNA salaku citakan.RT-qPCR geus dipaké dina rupa-rupa aplikasi biologi molekular, kaasup analisis ekspresi gén, validasi gangguan RNA, validasi microarray, deteksi patogén, nguji genetik, sarta panalungtikan panyakit.
Hiji-hambalan jeung dua-hambalan métode pikeun RT-qPCR
RT-qPCR tiasa dilakukeun ku cara hiji-léngkah atanapi dua-léngkah.Hiji-hambalan RT-qPCR ngagabungkeun transkripsi sabalikna jeung amplifikasi PCR, sahingga reverse transcriptase jeung DNA polymerase pikeun ngalengkepan réaksi dina tube sarua dina kaayaan panyangga sarua.Hiji-hambalan RT-qPCR ngan merlukeun pamakéan primers runtuyan-spésifik.Dina dua léngkah RT-qPCR, transkripsi ngabalikeun sareng amplifikasi PCR dilakukeun dina dua tabung, ngagunakeun panyangga anu dioptimalkeun, kaayaan réaksi, sareng strategi desain primer.
| Kauntungan | Kakurangan | |
| Hiji Lengkah | Métode ieu kurang kasalahan ékspérimén sabab duanana réaksi dilakukeun dina hiji tabung
Pangsaeutikna léngkah-léngkah pipetting ngirangan résiko kontaminasi
Cocog pikeun amplifikasi / screening high-throughput, gancang sareng tiasa diulang | Réaksi dua-léngkah teu tiasa dioptimalkeun nyalira
Kusabab kaayaan réaksi dikompromi ku ngagabungkeun réaksi dua-léngkah, sensitipitasna henteu saé tibatan metode dua-léngkah.
Jumlah target nu dideteksi ku sampel tunggal leutik |
| Dua Léngkah | Kamampuhan pikeun nyiptakeun perpustakaan cDNA anu stabil anu tiasa disimpen kanggo waktos anu lami sareng dianggo dina sababaraha réaksi
Gén target sareng gén rujukan tiasa diamplifikasi tina perpustakaan cDNA anu sami tanpa peryogi sababaraha perpustakaan cDNA.
Panyangga réaksi sareng kaayaan réaksi anu ngamungkinkeun optimasi jalanna réaksi tunggal
Pilihan fléksibel kaayaan pemicu | Ngagunakeun sababaraha tabung, sarta leuwih léngkah pipetting ngaronjatkeun résiko kontaminasi DNA, jeung waktu consuming.
Merlukeun leuwih optimasi ti metoda hiji-hambalan |
Produk patali:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Salah Léngkah)-SYBR Héjo I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Salah Lengkah)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Pikeun Sintésis CDNA First-Strand
Nyata Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Héjo I Kit
Pilihan total RNA jeung mRNA
Nalika ngarancang hiji percobaan RT-qPCR, hal anu penting pikeun mutuskeun ngagunakeun total RNA atawa mRNA dimurnikeun salaku citakan pikeun transkripsi sabalikna.Sanajan mRNA bisa nyadiakeun sensitipitas rada luhur, total RNA masih remen dipake.Alesan pikeun ieu nyaéta total RNA gaduh kaunggulan anu langkung penting salaku bahan awal tibatan mRNA.Kahiji, prosés merlukeun léngkah purifikasi pangsaeutikna, nu ensures recovery kuantitatif hadé tina citakan jeung normalisasi hadé hasilna mun dimimitian nomer sél.Kadua, éta ngahindarkeun léngkah pengayaan mRNA, anu tiasa ngahindarkeun kamungkinan hasil skewed kusabab pulihna béda tina mRNA anu béda.Gemblengna, sabab dina kalolobaan aplikasi kuantifikasi relatif gén target leuwih penting batan sensitipitas mutlak deteksi, total RNA leuwih cocog dina kalolobaan kasus.
Primer transkripsi sabalikna
Dina métode dua-lengkah, tilu métode béda bisa dipaké pikeun prime réaksi cDNA: primers oligo(dT), primers acak, atawa primers runtuyan-spésifik.Ilaharna, primers oligo(dT) jeung primers acak dipaké dina kombinasi.Primer ieu anil kana untaian mRNA citakan sarta nyadiakeun transkripse balik kalawan titik awal pikeun sintésis.
| Pilihan Primer | Struktur jeung pungsi | Kauntungan | Kakurangan |
| Oligo(dT) primer (atawa anchored oligo(dT) primer) | Anil diperpanjang ka résidu timin dina buntut poli(A) mRNA;primer jangkar oligo(dT) ngandung G, C, atawa A di tungtung 3′ (situs jangkar) | Sintésis cDNA pinuh-panjangna tina poli(A)-buntut mRNA
Larapkeun nalika kirang bahan awal sayogi
Situs jangkar mastikeun yén primer oligo(dT) ngabeungkeut kana buntut 5′ poli(A) mRNA. | Ukur cocog pikeun ngagedékeun gen sareng buntut poli(A).
Kéngingkeun cDNA dipotong tina situs priming*2 dina poli(A)
Bias ngabeungkeut kana tungtung 3′*
*Kamungkinan ieu diminimalkeun upami primers oligo(dT) anchored dianggo |
| primer acak
| 6 nepi ka 9 basa panjangna, nu bisa anneal ka sababaraha situs salila transkripsi RNA | Anil pikeun sakabéh RNA (tRNA, rRNA, jeung mRNA)
Cocog jeung transkrip kalawan struktur sekundér signifikan, atawa lamun kirang bahan awal sadia
Ngahasilkeun cDNA tinggi | cDNA ditranskripsi tibalik tina sakabéh RNA, nu biasana teu dihoyongkeun tur bisa éncér sinyal mRNA target.
meunang truncated cDNA |
| primers runtuyan-spésifik | Primer custom nargétkeun runtuyan mRNA husus | perpustakaan cDNA husus
Ningkatkeun sensitipitas
Ngagunakeun primers qPCR sabalikna | Ngan dugi ka sintésis gén target tunggal |
Reverse transcriptase
Reverse transcriptase nyaéta énzim anu ngagunakeun RNA pikeun nyintésis DNA.Sababaraha transkripase balikan gaduh aktivitas RNase sareng tiasa nguraikeun untaian RNA dina untaian hibrida RNA-DNA saatos transkripsi.Lamun teu mibanda aktivitas énzimatik RNase, RNaseH bisa ditambahkeun pikeun efisiensi qPCR luhur.Énzim anu biasa dianggo kalebet Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase sareng avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Pikeun RT-qPCR, éta idéal pikeun milih hiji transcriptase sabalikna kalawan thermostability luhur, ku kituna sintésis cDNA bisa dipigawé dina suhu luhur, mastikeun transkripsi suksés RNAs kalawan struktur sekundér luhur, bari ngajaga aktivitas pinuh maranéhanana sapanjang réaksi, hasilna cDNA ngahasilkeun leuwih luhur.
Produk patali:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Aktivitas RNase H tina reverse transcriptase
RNaseH tiasa nguraikeun untaian RNA tina duplexes RNA-DNA, ngamungkinkeun sintésis efisien DNA untaian ganda.Sanajan kitu, lamun ngagunakeun mRNA panjang salaku citakan, RNA bisa didegradasi prematurely, hasilna cDNA truncated.Ku alatan éta, mindeng mangpaat pikeun ngaleutikan aktivitas RNaseH salila kloning cDNA lamun sintésis transkrip panjang dipikahoyong.Kontras, reverse transcriptases kalawan aktivitas RNase H mindeng mangpaatna pikeun aplikasi qPCR sabab ningkatkeun lebur duplexes RNA-DNA salila siklus munggaran PCR.
Desain Primer
Primer PCR anu dipaké pikeun léngkah qPCR dina RT-qPCR idealna kudu dirarancang pikeun bentang hiji simpang exon-exon, dimana hiji primer amplifikasi berpotensi bentang hiji wates exon-intron sabenerna.Kusabab sekuen DNA génomik anu ngandung intron henteu diamplifikasi, desain ieu ngirangan résiko positip palsu anu diamplifikasi tina kontaminasi DNA génomik.
Lamun primers teu bisa dirancang pikeun misahkeun exon atawa wates exon-exon, nya meureun perlu pikeun ngubaran sampel RNA kalawan RNase bébas DNase I atawa dsDNase pikeun miceun kontaminasi DNA génomik.
kontrol RT-qPCR
Kontrol négatif transkripsi sabalikna (kontrol-RT) kedah kalebet dina sadaya percobaan RT-qPCR pikeun ngadeteksi kontaminasi DNA (sapertos DNA génomik atanapi produk PCR tina réaksi saméméhna).Kontrol ieu ngandung sadaya komponén réaksi kecuali reverse transcriptase.Kusabab transkripsi sabalikna teu lumangsung kalawan kontrol ieu, lamun amplifikasi PCR dititénan, kontaminasi tina DNA paling dipikaresep.
waktos pos: Aug-02-2022
