Dina tahap awal wabah, kusabab pamekaran anu gancang, diagnosis gancang pasien anu disangka mangrupikeun konci pikeun nyegah COVID-19.Sababaraha réagen deteksi asam nukléat anu disatujuan gaduh waktos pangembangan anu pondok, sareng aya masalah sapertos konpirmasi kinerja anu gancang, optimasi réagen anu teu cekap, sareng bédana ageung antara bets;Masalah rupa-rupa laboratorium klinis dina sagala rupa aspék prosés deteksi asam nukléat ogé tiasa mangaruhan katepatan hasil deteksi asam nukléat.Tulisan ieu bakal difokuskeun kana tautan sareng titik konci dina deteksi asam nukléat SARS-CoV-2 ayeuna, sareng nganalisis masalah pamariksaan ulang négatip sareng positif palsu tina deteksi asam nukléat laboratorium sareng inconsistency klinis.

Prinsip deteksi asam nukléat SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 mangrupikeun virus RNA kalayan sekuen génom sakitar 29 kb, sareng 10 gén, anu sacara efektif tiasa ngodekeun 10 protéin.Virus diwangun ku RNA sareng protéin, sareng lapisan pangluarna mangrupikeun lapisan luar anu diwangun ku lipid sareng glikoprotein.Di jerona, kapsid protéin ngabungkus RNA di jerona, ku kituna ngajagaan RNA anu gampang terurai (P1).

P1 Struktur SARS-COV-2

Virus nyerang sél ngaliwatan reséptor permukaan sél husus pikeun ngabalukarkeun inféksi, sarta ngagunakeun sél host pikeun ngayakeun réplikasi.

Prinsip deteksi asam nukléat virus nyaéta pikeun ngalaan RNA virus ngaliwatan lisat sél, teras nganggo réaksi ranté transkripsi-polimérase fluoresensi sacara real-time (RT-PCR) pikeun deteksi.

Konci pikeun prinsip deteksi nyaéta ngagunakeun primer sareng panyilidikan pikeun ngahontal "sasaran anu cocog" tina sekuen asam nukléat, nyaéta, milarian sekuen asam nukléat SARS-CoV-2 anu béda ti virus sanés dina sakitar 30,000 basa (kasaruaan asam nukléat sareng virus sanés) daérah "Low"), ngarancang primer sareng panyilidikan.

Primer sareng panyilidikan cocog pisan sareng daérah khusus asam nukléat SARS-CoV-2, nyaéta spésifisitasna kuat pisan.Sakali hasil amplifikasi RT-PCR fluoresensi real-time tina sampel anu bakal diuji positif, éta ngabuktikeun yén SARS-CoV-2 aya dina sampel.Tingali P2.

Léngkah P2 tina tekad asam nukléat SARS-CoV-2 (RT-PCR fluoresensi sacara real-time)

Kaayaan sareng syarat laboratorium pikeun deteksi asam nukléat SARS-CoV-2

Laboratorium tés asam nukléat anu paling idéal pikeun lingkungan tekanan négatip, sareng aranjeunna kedah nengetan ngawas tekanan, ngajaga hawa ngalir, sareng ngaleungitkeun aerosol.Personil tés asam nukléat kedah gaduh kualifikasi anu saluyu, nampi pelatihan réaksi ranté polimérase anu relevan sareng lulus penilaian.Laboratorium kedah dikokolakeun sacara ketat, dizonakeun di tempatna, sareng tanaga anu teu aya hubunganana dilarang pisan asup.Wewengkon anu bersih kedah ventilasi sareng disinfeksi di tempatna.Item relevan disimpen dina zona, beresih jeung kotor dipisahkeun, diganti dina waktu, sarta decontaminated di tempat.Disinfeksi rutin: Disinféktan anu ngandung klorin mangrupikeun solusi utama pikeun daérah anu langkung ageung, sareng 75% alkohol tiasa dianggo pikeun daérah leutik.Cara anu saé pikeun nungkulan aerosol nyaéta muka jandela pikeun ventilasi, sareng disinfeksi hawa ogé tiasa dilaksanakeun ku sinar ultraviolét, filtrasi, sareng disinfeksi hawa.

Tautan konci sareng parameter tina tekad asam nukléat SARS-CoV-2 (real-time fluoresensi RT-PCR)

Sanajan laboratorium umumna merhatikeun asam nukléat "deteksi", kanyataanna, asam nukléat "ékstraksi" oge salah sahiji hambalan konci pikeun deteksi suksés, nu raket patalina jeung ngumpulkeun jeung neundeun sampel virus.

Ayeuna, conto engapan anu paling seueur dianggo, sapertos swab nasopharyngeal, nganggo metode anu kadua, nyaéta solusi inaktivasi (pelestarian) anu disusun dumasar kana ékstraksi asam nukléat sareng larutan lisis.Di hiji sisi, solusi pelestarian virus ieu tiasa denaturasi protéin virus, leungit aktivitasna sareng henteu deui tepa, sareng ningkatkeun kasalametan tahap transportasi sareng deteksi;di sisi séjén, éta bisa langsung rengat virus pikeun ngaleupaskeun asam nukléat, ngaleungitkeun énzim decomposing asam nukléat, sarta nyegah virus.RNA didegradasi.

Solusi sampling virus anu disiapkeun dumasar kana solusi lisis ékstraksi asam nukléat.Komponén utama nyaéta uyah saimbang, agén chelating asam ethylenediaminetetraacetic, uyah guanidine (guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, jsb), surfactant anionik (dodecane) Natrium sulfat), surfactant kationik (tetradecyl trimethyl amonium oxalate), phenol, 8-thixyoquinase komponén séjén, 8-thixyoquinase protéin, atawa.Ayeuna, aya seueur jinis kit ékstraksi asam nukléat, sareng ékstraksi asam nukléat sareng réagen purifikasi dianggo.Sanajan ékstraksi asam nukléat sarua jeung réagen purifikasi dipaké, prosedur ékstraksi unggal kit béda.

Ayeuna, produk kit deteksi asam nukléat anu disatujuan ku Administrasi Produk Médis Nasional dipilih dumasar kana gén ORF1ab, E sareng N dina génom SARS-CoV-2.Prinsip deteksi produk anu béda dina dasarna sami, tapi primers sareng desain usikna béda.Aya bagéan target tunggal (ORF1ab), ruas target ganda (ORF1ab, N atanapi E), sareng bagéan tilu sasaran (ORF1ab, N sareng E).Beda antara deteksi jeung interpretasi, ékstraksi asam nukléat jeung sistem réaksi RT-PCR fluoresensi real-time kedah tingal parentah kit relevan, sarta eta disarankeun pikeun pamaké mastikeun nuturkeun metoda interpretasi dieusian dina parentah kit pikeun interpretasi.Wewengkon umum, primer sareng sekuen usik diamplifikasi ku RT-PCR fluoresensi sacara real-time dipidangkeun dina P3.

P3 Lokasi target amplicon SARS-CoV-2 dina génom sareng sekuen primer sareng panyilidikan

Interprétasi hasil penentuan asam nukléat SARS-CoV-2 (Real-Time fluoresensi RT-PCR)

"Rencana Pencegahan sareng Kontrol Pneumonia pikeun Inféksi SARS-CoV-2 (Edisi Kadua)" pikeun kahiji kalina ngajelaskeun kriteria pikeun nangtoskeun hasil amplifikasi gén tunggal:

1. Taya Ct atanapi Ct≥40 négatip;

2. Ct<37 nyaéta positip;

3. Nilai Ct 37-40 nyaéta wewengkon skala abu.Disarankeun ngulang percobaan.Lamun hasil redoing Ct <40 jeung kurva amplifikasi boga puncak atra, sampel bakal judged positif, disebutkeun négatip.

Pituduh édisi katilu jeung pituduh édisi kaopat nuluykeun kritéria di luhur.Nanging, kusabab targét anu béda-béda anu dianggo dina kit komersil, édisi ka-3 anu disebatkeun di luhur henteu masihan kritéria pikeun nangtukeun kombinasi target, nekenkeun Parentah anu disayogikeun ku pabrikan bakal lumaku.Dimimitian tina pedoman édisi kalima, dua udagan parantos dijelaskeun, khususna kritéria penilaian pikeun udagan tunggal anu hésé ditilik.Nyaéta, upami laboratorium hoyong mastikeun yén hiji kasus positip pikeun deteksi asam nukléat SARS-CoV-2, hal-hal ieu kedah nyumponan 1 tina 2 kaayaan:

(1) Dua target SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) dina conto anu sami diuji positip ku RT-PCR fluoresensi sacara real-time.Upami udagan tunggal positip, sampling ulang sareng uji ulang diperyogikeun.Lamun hasil tés téh Lamun target tunggal masih positif, mangka judged positif.

(2) Dua sampel real-time fluoresensi RT-PCR némbongkeun hiji udagan positif dina waktos anu sareng atawa dua sampel tina tipe sarua némbongkeun hiji udagan hasil test positif, nu bisa judged salaku positif.Tapi, pedoman ogé nekenkeun yén hasil négatip tina tés asam nukléat henteu tiasa ngaleungitkeun inféksi SARS-CoV-2.Faktor anu tiasa nyababkeun négatip palsu kedah dileungitkeun, kalebet kualitas sampel anu goréng (sampel engapan tina oropharynx sareng bagian sanésna), ngumpulkeun sampel teuing awal atanapi telat, Sampel henteu disimpen, diangkut, sareng diolah kalayan leres, sareng téknologi sorangan ngagaduhan masalah (variasi virus, inhibisi PCR), jsb.

Nyababkeun négatip palsu dina deteksi SARS-CoV-2

Konsep "negatif palsu" dina tés asam nukléat anu ayeuna prihatin, sering ngarujuk kana "négatif palsu" dimana hasil tés asam nukléat henteu saluyu sareng manifestasi klinis, nyaéta, gejala klinis sareng hasil pencitraan anu disangka COVID-19, tapi tés asam nukléat sok "négatip" sababaraha kali.Pusat Laboratorium Klinis Komisi Kaséhatan Nasional ngajelaskeun tés SARS-CoV-2 "negatif palsu".

(1) Aya sajumlah virus dina sél jalma anu katépaan.Data anu aya nunjukkeun yén saatos awak katépaan ku virus, virus asup kana tikoro ngaliwatan irung sareng sungut, teras ka trakea sareng bronchi, teras dugi ka alveoli.Jalma anu katépaan bakal ngalaman période inkubasi, gejala hampang, teras prosés gejala parah, sareng tahapan panyakit anu béda.Sareng jumlah virus anu aya dina sababaraha bagian awak béda-béda.

Dina hal viral load jenis sél, sél épitél alveolar (saluran pernapasan handap)> sél épitél saluran napas (saluran pernapasan luhur)> fibroblasts, sél endothelial, jeung makrofag, jsb;tina tipe sampel, cairan lavage alveolar (pang alusna)>sputum batuk jero> swab nasopharyngeal> swab oropharyngeal> getih.Sajaba ti éta, virus ogé bisa dideteksi dina tai.Sanajan kitu, tempo genah operasi sarta panarimaan pasien, urutan sampel klinis ilahar dipaké nyaéta swab oropharyngeal> swab nasopharyngeal> cairan lavage bronkial (operasi kompléks) jeung sputum jero (biasana batuk garing, hésé pikeun ménta).

Ku alatan éta, jumlah virus dina sél oropharynx atawa nasopharynx sababaraha pasien leutik atawa pisan low.Upami ngan ukur conto oropharynx atanapi nasopharynx anu dicandak pikeun diuji, asam nukléat virus moal dideteksi.

(2) Henteu aya sél anu ngandung virus anu dikumpulkeun nalika ngumpulkeun sampel, atanapi asam nukléat virus henteu dilestarikan sacara efektif.

[① Situs pangumpulan anu teu leres, contona, nalika ngumpulkeun swab oropharyngeal, jerona koléksi henteu cekap, swab nasopharyngeal anu dikumpulkeun henteu dikumpulkeun dina jero rohangan irung, jsb. Seuseueurna sél anu dikumpulkeun tiasa janten sél bébas virus;

②Sampling swabs dipaké teu bener.Salaku conto, serat sintétik sapertos serat PE, serat poliéster sareng serat polipropilén disarankeun pikeun bahan sirah swab.Serat alam kayaning katun dipaké dina operasi sabenerna (adsorption kuat protéin jeung teu gampang keur nyeuseuh kaluar) Jeung serat nilon (nyerep cai goréng, ngarah kana volume sampling cukup);

③Pamakean tabung panyimpen virus anu salah, sapertos nyalahgunakeun tabung panyimpen plastik polipropilén atanapi poliétilén anu gampang nyerep asam nukléat (DNA/RNA), nyababkeun panurunan dina konsentrasi asam nukléat dina leyuran panyimpenan.Dina prakna, disarankeun ngagunakeun plastik poliétilén-propilén polimér sareng sababaraha wadah plastik polipropilén anu dirawat khusus pikeun nyimpen asam nukléat virus.]

[① Situs pangumpulan anu teu leres, contona, nalika ngumpulkeun swab oropharyngeal, jerona koléksi henteu cekap, swab nasopharyngeal anu dikumpulkeun henteu dikumpulkeun dina jero rohangan irung, jsb. Seuseueurna sél anu dikumpulkeun tiasa janten sél bébas virus;

②Sampling swabs dipaké teu bener.Salaku conto, serat sintétik sapertos serat PE, serat poliéster sareng serat polipropilén disarankeun pikeun bahan sirah swab.Serat alam kayaning katun dipaké dina operasi sabenerna (adsorption kuat protéin jeung teu gampang keur nyeuseuh kaluar) Jeung serat nilon (nyerep cai goréng, ngarah kana volume sampling cukup);

③Pamakean tabung panyimpen virus anu salah, sapertos nyalahgunakeun tabung panyimpen plastik polipropilén atanapi poliétilén anu gampang nyerep asam nukléat (DNA/RNA), nyababkeun panurunan dina konsentrasi asam nukléat dina leyuran panyimpenan.Dina prakna, disarankeun ngagunakeun plastik poliétilén-propilén polimér sareng sababaraha wadah plastik polipropilén anu dirawat khusus pikeun nyimpen asam nukléat virus.]

(4) Operasi laboratorium klinis henteu standar.Kaayaan transportasi sareng panyimpen conto, operasi standar laboratorium klinis, interpretasi hasil sareng kontrol kualitas mangrupikeun faktor konci pikeun mastikeun katepatan sareng reliabilitas hasil tés.Numutkeun hasil evaluasi kualitas éksternal anu dilakukeun ku Pusat Laboratorium Klinik Komisi Kaséhatan Nasional tanggal 16-24 Maret 2020, tina 844 laboratorium anu nampi hasil anu valid, 701 (83.1%) mumpuni, sareng 143 (16.9%) henteu.Kualifikasi, kaayaan uji laboratorium sadayana saé, tapi laboratorium anu béda-béda masih gaduh bédana dina kamampuan operasi tanaga, kamampuan interpretasi sampel positip target tunggal, sareng kontrol kualitas.

Kumaha carana ngirangan négatip palsu tina deteksi asam nukléat SARS-CoV-2?

Ngurangan négatip palsu dina deteksi asam nukléat kedah dioptimalkeun tina opat aspék ngahasilkeun négatip palsu.

(1) Aya sajumlah virus dina sél jalma anu katépaan.Konsentrasi virus dina bagian anu béda dina awak jalma anu disangka katépaan bakal béda dina waktos anu béda.Upami teu aya pharynx, éta tiasa aya dina cairan lavage bronchial atanapi tai.Upami sababaraha jinis conto tiasa dikumpulkeun dina waktos anu sami atanapi dina tahap anu béda tina kamajuan panyakit pikeun diuji, Bakal ngabantosan ngahindarkeun négatip palsu.

(2) Sél nu ngandung virus kudu dikumpulkeun salila ngumpulkeun sampel.masalah ieu bisa direngsekeun ka extent badag ku strengthening latihan kolektor sampel.

(3) réagen IVD dipercaya.Ku ngalaksanakeun panalungtikan ngeunaan évaluasi kinerja deteksi réagen di tingkat nasional, sareng ngabahas masalah anu aya, efisiensi deteksi réagen tiasa langkung ningkat sareng sensitipitas analisis tiasa ningkat.

(4) Operasi standar laboratorium klinis.Ku nguatkeun palatihan tanaga laboratorium, terus-terusan ningkatkeun sistem manajemen kualitas laboratorium, mastikeun divisi anu wajar, sareng ningkatkeun kamampuan personel pikeun ngadeteksi, kamungkinan pikeun ngirangan négatip palsu kusabab operasi laboratorium anu teu leres.

Alesan pikeun tés ulang positip tina tés asam nukléat SARS-CoV-2 dina pasien pulih sareng dikaluarkeun

"Rencana Diagnosis sareng Perawatan COVID-19 (Edisi Katujuh Percobaan)" jelas netepkeun yén salah sahiji kritéria pikeun pasien COVID-19 diubaran sareng dikaluarkeun tina rumah sakit nyaéta dua conto saluran pernapasan anu berturut-turut gaduh tés asam nukléat négatip (sahenteuna 24 jam), tapi aya sakedik pisan pasien SARS-CoV-2 dina tés asam nukléat dicas deui positip.

(1)SARS-CoV-2 nyaéta virus anyar.Perlu langkung ngartos mékanisme patogénna, gambaran lengkep ngeunaan panyakit anu disababkeun sareng karakteristik kursus panyakit.Ku alatan éta, di hiji sisi, perlu pikeun nguatkeun manajemen pasien discharged sarta ngalaksanakeun observasi médis 14 poé.Ngalaksanakeun tindak lanjut, ngawas kaséhatan sareng bimbingan kaséhatan pikeun langkung jero pamahaman sadayana prosés kajadian, pamekaran sareng hasil tina panyakit.

(2) Pasién tiasa kainfeksi virus deui.Akademisi Zhong Nanshan nyarios: Kusabab pasien anu kapok gaduh antibodi, SARS-CoV-2 tiasa dileungitkeun ku antibodi nalika aranjeunna nyerang deui.Aya seueur alesan, anu tiasa janten panyabab pasien pulih, atanapi tiasa aya hubunganana sareng mutasi virus, atanapi bahkan anu nyababkeun tés laboratorium.Upami éta virus sorangan, mutasi SARS-CoV-2 tiasa nyababkeun antibodi anu diproduksi ku pasien anu pulih henteu efektif ngalawan virus anu mutasi.Upami pasien kainfeksi virus mutasi deui, tés asam nukléat tiasa positip deui.

(3) Sajauh ngeunaan metode tés laboratorium, unggal metodeu tés gaduh watesan.Deteksi asam nukléat SARS-CoV-2 disababkeun ku pilihan sekuen gen, komposisi réagen, sensitipitas metode sareng alesan sanésna, ngarah kana kit anu tos aya gaduh wates deteksi anu handap.Saatos pasien dirawat, virus dina awak ngirangan.Nalika viral load dina sampel anu bakal diuji sahandapeun wates deteksi handap, hasil "négatip" bakal muncul.Sanajan kitu, hasilna ieu lain hartosna yén virus dina awak geus leungit lengkep.Virusna tiasa saatos pangobatan dieureunkeun.Resurgence”, terus nyalin.Ku alatan éta, disarankeun pikeun marios saminggu sakali dina 2 dugi ka 4 minggu saatos tuang.

(4) Asam nukléat nyaéta bahan genetik virus.Virus ieu tiwas saatos pasien parantos ngajalanan perawatan antiviral, tapi sésa-sésa fragmen RNA virus masih disimpen dina awak manusa, sareng henteu lengkep dikaluarkeun tina awak.Sakapeung, dina kaayaan anu tangtu, éta tiasa langkung dipikagaduh.Lila-lila, sarta dina waktos ieu tés asam nukléat bakal "transient" positif.Kalayan perpanjangan waktos pamulihan pasien, saatos sésa-sésa fragmen RNA dina awak laun-laun béak, hasil tés asam nukléat tiasa négatip.

(5) Hasil uji asam nukléat SARS-CoV-2 ngan ukur ngabuktikeun ayana atanapi henteuna RNA virus, sareng henteu tiasa ngabuktikeun kagiatan virus sareng naha virusna tiasa ditularkeun.Perlu dibuktikeun naha pasién anu ngagaduhan tés asam nukléat positip deui bakal janten sumber inféksi deui.Perlu ngalaksanakeun budaya virus dina conto klinis sareng ngokolakeun virus "hirup" pikeun ngabuktikeun yén éta tepa.

Ringkesan

Kasimpulanana, tés asam nukléat SARS-CoV-2 négatif palsu, tés ulang positip, sareng kaayaan sanés anu teu konsisten sareng manifestasi klinis teu tiasa dihindari sacara lengkep.Dina saringan sareng uji saleresna, disarankeun pikeun ngagabungkeun gejala klinis, pamariksaan pencitraan (CT) sareng ékspérimén Uji laboratorium (uji asam nukléat + tés antibodi khusus virus) pikeun diagnosis komprehensif pikeun nyegah diagnosis anu lasut sareng salah diagnosis.Lamun hasil tés kapanggih écés inconsistent jeung manifestasi klinis, eta disarankeun pikeun ngalakonan analisa komprehensif ngeunaan sakabéh link test (kumpulan sampel, sirkulasi jeung processing link) pikeun ngaluarkeun inféksi awal virus SARS-CoV-2, inféksi kumat atawa digabungkeun jeung inféksi virus pernapasan séjén, jsb mungkin.Upami kaayaan ngijinkeun, disarankeun pikeun ngumpulkeun conto anu langkung sénsitip sapertos sputum atanapi cairan lavage alveolar pikeun ujian ulang.

Produk patali:

Kit Deteksi Asam Nukléat SARS-CoV-2 (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method)