Verifikasi kinerja primers sareng panyilidikan dina tahap awal réagen PCR sareng nangtoskeun kaayaan réaksi anu paling cocog mangrupikeun prasyarat pikeun mastikeun kamajuan lancar percobaan formal.
Janten kumaha urang kedah mastikeun usik primer dina tahap awal?
Indikator utama nyaéta garis dasar, kurva amplifikasi, nilai ct, efisiensi amplifikasi, deteksi sampel konsentrasi rendah, CV, jsb.
Dasar
Garis dasar nyaéta garis horizontal dina kurva amplifikasi PCR.Dina sababaraha siklus mimiti réaksi amplifikasi PCR, sinyal fluoresensi teu robah teuing tur ngabentuk garis lempeng.Garis lempeng ieu mangrupikeun garis dasar.
Nalika saringan panyilidikan primer PCR, perhatikeun naha garis dasarna tingkat.Kemurnian konsentrasi usik primer bakal mangaruhan garis dasar, sapertos nyababkeun garis dasar naek atanapi turun.Dasarna ogé indikator anu intuitif pisan.
Kurva amplifikasi
Indikator intuitif séjén nyaéta bentuk kurva amplifikasi.Hadé pisan mun éta mibanda kurva S ngawangun pikeun nyingkahan amplifikasi sekundér atawa kurva amplifikasi abnormal lianna.
Nilai Ct
Jumlah siklus pakait jeung titik inflection ti baseline kana tumuwuhna éksponénsial nyaeta nilai Ct.
Pikeun conto anu sami, panyilidikan primer anu béda-béda nyababkeun kurva amplifikasi anu béda, sareng nilai Ct anu saluyu bakal kapangaruhan ku efisiensi amplifikasi sareng gelar gangguan.Dina tiori, nu leuwih leutik nilai Ct tina usik Primer kami milih, nu hadé.
Éfisiensi amplifikasi
Salah sahiji metodeu anu paling dipercaya sareng stabil pikeun ngevaluasi efisiensi amplifikasi PCR nyaéta kurva standar, anu ogé diakui sacara lega ku panaliti.Metoda ngalibatkeun nyieun runtuyan sampel pikeun ngadalikeun jumlah relatif template target.Sampel ieu biasana dilakukeun ku éncér séri tina solusi saham pekat, anu paling sering dianggo nyaéta éncér 10-melu.Ngagunakeun runtuyan sampel éncér, ngagunakeun program qPCR baku pikeun ngagedékeun pikeun ménta nilai Cq, sarta tungtungna ngagambar kurva baku nurutkeun konsentrasi unggal sampel sarta nilai Cq pakait pikeun ménta persamaan linier Cq = -klgX0 + b, sarta efisiensi amplifikasi E = 10 (-1 / k) -1.Nalika nganggo qPCR pikeun analisa kuantitatif, efisiensi amplifikasi kedah aya dina kisaran 90% -110% (3.6>k>3.1).
Low-konsentrasi Sampel Deteksi
Nalika konsentrasi sampel rendah, laju deteksi panyilidikan primer anu béda-béda béda.Urang milih 20 sampel low-konsentrasi pikeun ngayakeun réplikasi, sarta sistem primer-usik kalawan laju deteksi pangluhurna nyaéta pangalusna.
Koéfisién Variasi (CV)
10 sampel duplikat bisa dideteksi ku panyilidikan Primer béda nurutkeun standar garis réagen pikeun deteksi Gedekeun asam nukléat.
Réagen kuantitatif:
Akurasi
Katepatan dina hiji bets kedah nyumponan: koefisien variasi (CV,%) tina nilai logaritmik konsentrasi tés nyaéta ≤5%.Nalika konsentrasi sampel rendah, koefisien variasi (CV,%) tina logaritma konsentrasi deteksi nyaéta ≤10%
réagen kualitatif:
Akurasi
Katepatan dina hiji bets kedah nyumponan:
(1) Koéfisién variasi nilai Ct (CV,%) ≤5%
Sampel anu sami diuji paralel 10 kali, sareng hasil tés kedah konsisten
waktos pos: Sep-18-2021
