Dina percobaan qPCR, desain primer ogé mangrupikeun tautan anu penting pisan.Naha primers cocog atanapi henteu raket patalina sareng naha efisiensi amplifikasi ngahontal standar, naha produk amplifikasi spésifik, sareng naha hasil ékspérimén sayogi.
Janten kumaha carana ngadamel spésifisitas primer qPCR langkung saé?Efisiensi amplifikasi tinggi?
Dinten ieu, urang bakal mawa anjeun pikeun ngarancang primers qPCR babarengan, sarta ngantep qPCR desain primér jadi skill lore efisien dina percobaan.
Nalika ngarancang primers qPCR, biasana nengetan titik-titik di handap ieu: primers kudu dirancang sakuliah introns saloba mungkin, panjang produk kudu 100-300 bp, nilai Tm kudu sacaket mungkin ka 60 ° C, jeung primers hulu jeung hilir kudu sacaket mungkin, jeung tungtung Primer kudu G atawa C, jsb antosan.
1. Desain primers ngawengku introns
Nalika ngarancang primer qPCR, milih primer anu dirarancang dina intron tiasa nyegah template gDNA tina amplified, sareng produkna sadayana diturunkeun tina amplifikasi cDNA, sahingga ngaleungitkeun pangaruh kontaminasi gDNA.
2. Panjang Primer
Panjang primer umumna antara 18-30 nt, sareng panjang produk amplifikasi kedah dikawasa antara 100-300 bp saloba mungkin.
Upami Primer pondok teuing, éta bakal ngakibatkeun amplifikasi non-spésifik, sareng upami panjang teuing, éta bakal gampang ngabentuk struktur sekundér (sapertos struktur jepit rambut).Upami produk amplifikasi panjang teuing, éta henteu cocog pikeun réaksi polimérase, anu bakal mangaruhan efisiensi amplifikasi PCR.
3. eusi GC jeung nilai Tm
Eusi GC primers kudu dikawasa antara 40% jeung 60%.Upami éta luhur teuing atanapi rendah teuing, éta henteu kondusif pikeun ngamimitian réaksi.Eusi GC tina primers maju jeung mundur kudu deukeut jeung sarua dina urutan pikeun ménta nilai Tm sarua jeung suhu annealing.
Nilai Tm kedahna antara 55-65°C sajauh mungkin, umumna sakitar 60°C, sareng nilai Tm hulu sareng hilir kedah sacaket mungkin, langkung saé henteu langkung ti 4°C.
4. Hindarkeun milih A dina tungtung 3′ primer
Nalika tungtung 3' tina primer teu cocog, aya bédana hébat dina efisiensi sintésis basa béda.Nalika basa panungtungan nyaéta A, eta oge bisa initiate sintésis ranté malah dina kasus mismatching, sarta lamun basa panungtungan nyaéta T Nalika, efisiensi induksi mismatch ieu greatly ngurangan.Ku alatan éta, coba ulah milih A dina tungtung 3' tina primer, sarta eta leuwih hade milih T.
Lamun mangrupa Primer usik, 5 'tungtung usik teu bisa G, sabab sanajan basa G tunggal disambungkeun ka grup reporter fluoresensi FAM, G ogé bisa quench sinyal fluoresensi dipancarkeun ku grup FAM, hasilna hasil négatip palsu.Nembongan.
5. Sebaran dasar
Distribusi tina opat basa dina primer leuwih hade acak, ngahindarkeun leuwih ti 3 padeukeut G atawa C dina tungtung 3′, sarta leuwih ti 3 padeukeut.G atawa C gampang pikeun ngahasilkeun papasangan di wewengkon runtuyan-euyeub GC.
6. Wewengkon desain primer kedah nyingkahan struktur sekundér kompléks.
Struktur sekundér anu dibentuk ku untaian tunggal produk amplifikasi bakal mangaruhan kamajuan lancar PCR.Ku ngaramal naha aya struktur sekundér dina urutan udagan sateuacanna, coba ulah wewengkon ieu dina rarancang primers.
7. Primer sorangan jeung antara primers kudu nyoba nyingkahan basa pelengkap padeukeut.
Henteu aya komplementaritas 4 dasar anu berturut-turut antara primer sareng primer.Primer sorangan teu kudu boga runtuyan pelengkap, disebutkeun eta bakal melu sorangan pikeun ngabentuk struktur hairpin, nu bakal mangaruhan kombinasi annealing tina Primer jeung template.
Sekuen komplementer teu tiasa aya antara primer hulu sareng hilir.Komplementaritas antara primers bakal ngahasilkeun dimer primer, nu bakal ngurangan efisiensi PCR komo mangaruhan akurasi kuantitatif.Upami struktur primer-dimer sareng jepit rambut teu tiasa dihindari, nilai △G teu kedah luhur teuing (kedahna kirang ti 4,5 kcal/mol).
8. Primer ngagedékeun produk husus target.
Tujuan pamungkas tina deteksi qPCR nyaeta ngartos kaayaanana gén target.Lamun amplifikasi non-spésifik lumangsung, kuantifikasi bakal akurat.Ku alatan éta, sanggeus primers dirancang, maranéhanana kudu diuji ku BLAST, sarta spésifisitas produk dibandingkeun dina database runtuyan.
Salajengna, urang nyandak GAS6 manusa (Pertumbuhan ditewak husus 6) gén salaku conto pikeun ngarancang primers qPCR.
01 gén query
Homo GAS6ngaliwatan NCBI.Di dieu, urang kedah nengetan ngabandingkeun nami gén sareng spésiés pikeun mastikeun yén aranjeunna konsisten.
02 Manggihan runtuyan gén
(1) Upami sekuen targétna nyaéta DNA génomik, pilih anu kahiji, nyaéta sekuen DNA génomik gén.
(2) Lamun runtuyan udagan mRNA, pilih nu kadua.Sanggeus ngasupkeun, klik "CDS" dina tabel di handap ieu.Runtuyan latar coklat nyaéta runtuyan coding gén.
03 Desain primér
Lebetkeun panganteur Primer-BLAST
Lebetkeun nomer runtuyan gén atawa runtuyan dina format Fasta di kénca luhur, sarta eusian parameter relevan.

Klik "Get primers" na NCBI bakal pop up ngabejaan Anjeun yen pilihan parameter sapertos bakal amplified kana varian splicing séjén.Urang tiasa pariksa varian splicing béda jeung ngalebetkeun aranjeunna pikeun meunangkeun pasangan Primer luyu (sakumaha ditémbongkeun dina gambar di handap).Proses ieu tiasa nyandak puluhan detik kanggo ngajalankeun.
Suhu anil tina pasangan primer ieu sadayana sakitar 60 ° C.Numutkeun tujuan percobaan, milih primers kalayan panjangna sedeng, spésifisitas alus tur kirang timer complementation tina primers pikeun percobaan, sarta laju kasuksésan anu cukup luhur!
04Verifikasi spésifisitas Primer
Kanyataanna, salian ti ngarancang primers, Primer-Blast ogé bisa evaluate primers kami dirancang sorangan.Balik deui ka halaman desain primér, asupkeun primers hulu sareng hilir anu kami rancang, sareng parameter sanés moal disaluyukeun.Saatos ngirimkeun, anjeun tiasa ningali naha pasangan primer ogé aya dina gen sanés.Upami sadayana ditampilkeun dina gén anu urang badé ngagedékeun, nunjukkeun yén spésifisitas pasangan primer ieu hébat!(Contona, ieu hiji-hijina hasil tina query primer!)

05 Penilaian kualitas Primer
Jenis primer nyaéta primer "sampurna" anu ngagabungkeun "efisiensi amplifikasi dugi ka standar", "karakteristik produk anu diamplifikasi", sareng "hasil ékspérimén anu dipercaya"?
Éféktivitas amplifikasi

kurva lebur
Efisiensi amplifikasi tina primers ngahontal 90% -110%, nu hartina efisiensi amplifikasi alus, sarta kurva lebur boga puncak tunggal jeung biasana Tm> 80 ° C, nu hartina spésifisitas amplifikasi alus.
 
Produk patali:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman