Téknologi diagnosis molekular ngagunakeun métode biologi molekular pikeun ngadeteksi éksprési sareng struktur bahan genetik awak manusa sareng rupa-rupa patogén, ku kituna ngahontal tujuan ngaramal sareng ngadiagnosis panyakit.

Dina taun-taun ayeuna, kalayan paningkatan sareng pengulangan téknologi diagnostik molekular, aplikasi klinis diagnostik molekular parantos langkung seueur sareng langkung jero, sareng pasar diagnostik molekular parantos lebet kana jaman pangembangan anu gancang.

Panulis nyimpulkeun téknologi diagnostik molekular umum di pasar, sareng dibagi kana tilu bagian: bagian kahiji ngenalkeun téknologi PCR, bagian kadua ngenalkeun téknologi amplifikasi isothermal asam nukléat, sareng bagian kadua ngawanohkeun téknologi sequencing.

01

Bagian I: Téhnologi PCR

téhnologi PCR

PCR (réaksi ranté polimérase) nyaéta salah sahiji téknologi amplifikasi DNA in vitro, kalayan sajarahna leuwih ti 30 taun.

Téknologi PCR naratas taun 1983 ku Kary Mullis ti Cetus, AS.Mullis ngalamar patén PCR di 1985 sareng nyebarkeun makalah akademik PCR munggaran ngeunaan Élmu dina taun anu sami.Mullis meunang Hadiah Nobel Kimia dina 1993.

Prinsip Dasar PCR

PCR tiasa ngagedékeun fragmen DNA target ku langkung ti sajuta kali.Prinsipna nyaéta dina katalisis DNA polimérase, untaian DNA induk dipaké salaku citakan, sarta primer husus dipaké salaku titik awal pikeun extension.Ieu replicated in vitro ngaliwatan léngkah kayaning denaturation, annealing, sarta extension.Prosés DNA untai putri pelengkap DNA untaian induk template.

Prosés PCR standar dibagi kana tilu léngkah:

1. Denaturasi: Paké suhu luhur pikeun misahkeun untaian ganda DNA.Beungkeut hidrogén antara untaian ganda DNA pegat dina suhu luhur (93-98°C).

2. Annealing: Saatos DNA untai ganda dipisahkeun, suhu diturunkeun supados primer tiasa ngabeungkeut DNA untaian tunggal.

3. Ekstensi: DNA polimérase mimiti nyintésis untaian komplementer sapanjang untaian DNA tina primers kabeungkeut nalika suhu diturunkeun.Nalika extension geus réngsé, siklus geus réngsé, sarta jumlah fragmen DNA ganda.

Malikkeun tilu léngkah ieu 25-35 kali, jumlah fragmén DNA bakal ningkat sacara éksponénsial.

Kacerdasan PCR nyaéta yén primer anu béda-béda tiasa dirarancang pikeun gen udagan anu béda-béda, ku kituna fragmen gén target tiasa diamplifikasi dina waktos anu pondok.

Sajauh ieu, PCR tiasa dibagi kana tilu kategori, nyaéta PCR biasa, PCR kuantitatif fluoresensi sareng PCR digital.

Generasi kahiji PCR biasa

Anggo alat amplifikasi PCR biasa pikeun ngagedékeun gén target, teras nganggo éléktroforésis gél agarose pikeun ngadeteksi produk, ngan ukur analisa kualitatif anu tiasa dilakukeun.

Karugian utama PCR generasi kahiji:

-Rawan kana amplifikasi non-spésifik sareng hasil positip palsu.

-Deteksi butuh waktos anu lami sareng operasina pajeujeut.

- Ngan ukur tés kualitatif anu tiasa dilakukeun.

PCR kuantitatif fluoresensi generasi kadua

PCR kuantitatif fluoresensi (Real-Time PCR), ogé katelah qPCR, dipaké pikeun ngawas akumulasi produk amplified ngaliwatan akumulasi sinyal fluoresensi ku nambahkeun panyilidikan fluoresensi nu bisa nunjukkeun kamajuan sistem réaksi, sarta pikeun nangtoskeun hasil ngaliwatan kurva fluoresensi, sarta Ieu bisa diitung kalayan bantuan nilai Cq jeung kurva baku.

Kusabab téknologi qPCR dilaksanakeun dina sistem katutup, kamungkinan kontaminasi diréduksi, sareng sinyal fluoresensi tiasa diawaskeun pikeun deteksi kuantitatif, ku kituna éta paling seueur dianggo dina prakték klinis sareng parantos janten téknologi dominan dina PCR.

Zat fluoresensi dipaké dina PCR kuantitatif fluoresensi real-time bisa dibagi kana: TaqMan panyilidikan fluoresensi, beacons molekular jeung dyes fluoresensi.

1) TaqMan usik fluoresensi:

Salila amplifikasi PCR, usik fluoresensi husus ditambahkeun bari nambahkeun sapasang primers.Panyilidikan mangrupa oligonukleotida, sarta dua tungtung masing-masing dilabélan ku gugus fluoresensi reporter jeung grup fluoresensi quencher.

Nalika usik gembleng, sinyal fluoresensi dipancarkeun ku grup reporter kaserep ku grup quenching;salila amplifikasi PCR, aktivitas exonuclease 5′-3′ énzim Taq cleaves jeung degrades usik, nyieun reporter group fluoresensi jeung quencher Grup fluoresensi dipisahkeun, jadi sistem ngawaskeun fluoresensi bisa narima sinyal fluoresensi, nyaeta, unggal waktu strand DNA ieu amplified lengkep, formasi fluoresensi fluoresensi, jeung molekul ieu akumulasi fluoresensi. produk PCR.

2) SYBR pewarna fluoresensi:

Dina sistem réaksi PCR, kaleuwihan ngalelep fluoresensi SYBR ditambahkeun.Saatos pewarna fluoresensi SYBR henteu sacara khusus diasupkeun kana untaian ganda DNA, éta ngaluarkeun sinyal fluoresensi.Molekul pewarna SYBR anu henteu diasupkeun kana ranté moal ngaluarkeun sinyal fluoresensi, ku kituna mastikeun sinyal fluoresensi Kanaékan produk PCR lengkep disingkronkeun sareng paningkatan produk PCR.SYBR ukur ngabeungkeut DNA untaian ganda, jadi kurva lebur bisa dipaké pikeun nangtukeun naha réaksi PCR husus.

3) Beacon molekular

Éta mangrupikeun panyilidikan oligonukleotida anu dilabélan ganda-loop anu ngawangun struktur jepit rambut sakitar 8 basa dina 5 sareng 3 tungtung.Runtuyan asam nukléat dina duanana tungtung téh complementarily dipasangkeun, ngabalukarkeun grup fluoresensi jeung gugus quenching jadi ketat.Tutup, éta moal ngahasilkeun fluoresensi.

Saatos produk PCR dihasilkeun, salila prosés annealing, bagian tengah lantera molekular dipasangkeun jeung runtuyan DNA husus, sarta gén fluoresensi dipisahkeun tina gén quencher pikeun ngahasilkeun fluoresensi.

Karugian utama PCR generasi kadua:

Sensitipitas masih kurang, sarta deteksi spésimén low-salinan teu akurat.

Aya pangaruh nilai latar, sarta hasilna rentan ka gangguan.

PCR digital generasi katilu

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ngitung jumlah salinan tina runtuyan target ngaliwatan deteksi titik tungtung, sarta bisa ngalakukeun deteksi kuantitatif mutlak akurat tanpa ngagunakeun kadali internal tur kurva baku.

Digital PCR ngagunakeun deteksi titik tungtung sarta henteu gumantung kana nilai Ct (siklus bangbarung), jadi réaksi PCR digital kirang kapangaruhan ku efisiensi amplifikasi, sarta kasabaran kana sambetan réaksi PCR ningkat, kalawan akurasi tinggi na reproducibility.

Kusabab karakteristik sensitipitas anu luhur sareng akurasi anu luhur, éta henteu gampang diganggu ku sambetan réaksi PCR, sareng éta tiasa ngahontal kuantitas mutlak anu leres tanpa produk standar, anu parantos janten hotspot panalungtikan sareng aplikasi.

Nurutkeun kana bentuk béda tina Unit réaksi, éta bisa dibagi kana tilu jenis: microfluidic, chip sarta sistem droplet.