Nilai Ct mangrupikeun bentuk presentasi hasil anu paling penting tina PCR kuantitatif fluoresensi.Hal ieu dipaké pikeun ngitung béda ekspresi gén atawa nomer salinan gén.Janten naon nilai Ct kuantitas fluoresensi dianggap wajar?Kumaha carana mastikeun rentang efektip nilai Ct?
Naon Nilai Ct?
Salila prosés amplifikasi qPCR, jumlah saluyu tina siklus amplifikasi (Siklus Ambang) nalika sinyal fluoresensi produk amplified ngahontal bangbarung fluoresensi set.C nangtung pikeun Cycle sareng T nangtung pikeun Ambang.Kantun nempatkeun, nilai Ct nyaeta jumlah siklus pakait jeung nalika amplifikasi template awal ngahontal jumlah nu tangtu produk di qPCR.Anu disebut "jumlah produk anu tangtu" bakal dijelaskeun engké.
Naon anu dilakukeun ku nilai Ct?
1.Hubungan antara amplifikasi eksponensial, Jumlah template na nilai Ct
Ideally, gén dina qPCR akumulasi ku amplifikasi éksponénsial sanggeus sababaraha siklus.Hubungan antara jumlah siklus amplifikasi jeung jumlah produk nyaéta: Jumlah produk amplified = jumlah template awal × (1+En) jumlah siklus.Sanajan kitu, réaksi qPCR henteu salawasna dina kaayaan idéal.Lamun jumlah produk amplified ngahontal "jumlah produk tangtu", jumlah siklus dina waktu ieu nilai Ct, sarta éta dina periode amplifikasi eksponensial.Hubungan antara nilai Ct jeung jumlah dimimitian template: Aya hubungan linier antara nilai Ct template jeung logaritma tina jumlah salinan awal template.Nu leuwih luhur konsentrasi template awal, nu leutik nilai Ct;nu handap konsentrasi template awal, nu leuwih gede nilai Ct.
2.Amplification kurva, bangbarung fluoresensi sarta jumlah produk PCR tangtu
Jumlah produk amplifikasi qPCR langsung dibere dina bentuk sinyal fluoresensi, nyaéta, kurva amplifikasi.Dina tahap awal PCR, amplifikasi dina kaayaan idéal, jumlah siklus leutik, akumulasi produk leutik, sarta tingkat fluoresensi teu bisa jelas dibédakeun tina latar tukang fluoresensi.Saatos éta, fluoresensi naék sareng asup kana fase éksponénsial.Jumlah produk PCR bisa ditandaan dina titik nu tangtu nalika réaksi PCR ngan dina fase eksponensial, nu bisa dipaké salaku "jumlah produk nu tangtu", sarta eusi awal template bisa deduced tina ieu.Ku alatan éta, inténsitas sinyal fluoresensi pakait jeung jumlah nu tangtu produk nyaeta bangbarung fluoresensi.
Dina tahap ahir PCR, kurva amplifikasi henteu deui nunjukkeun amplifikasi eksponensial, sareng asup kana fase linier sareng fase dataran.
3.Reproducibility tina nilai Ct
Nalika siklus PCR ngahontal jumlah siklus tina nilai Ct, éta nembé asup kana période amplifikasi éksponénsial anu leres.Dina waktos ayeuna, kasalahan leutik teu acan diamplified, jadi reproducibility tina nilai Ct alus teuing, nyaeta, template sarua geus amplified dina waktu nu beda atawa dina tabung béda dina waktos anu sareng.Amplifikasi, nilai Ct diala konstan.
1.Efisiensi amplifikasi En
Efisiensi amplifikasi PCR nujul kana efisiensi anu polimérase ngarobah gén pikeun diamplifikasi kana amplicon.Efisiensi amplifikasi nalika hiji molekul DNA dirobah jadi dua molekul DNA nyaéta 100%.Efisiensi amplifikasi ilaharna dinyatakeun salaku En.Pikeun ngagampangkeun analisa artikel saterasna, faktor anu mangaruhan efisiensi amplifikasi diwanohkeun sakedap.
| Faktor anu mangaruhan | katerangan | Kumaha nangtoskeun? |
| A. sambetan PCR | 1. DNA template ngandung zat anu ngahambat réaksi PCR, kayaning protéin atawa detergents.2. The cDNA sanggeus transkripsi sabalikna ngandung konsentrasi luhur template RNA atanapi RT komponén réagen, nu ogé bisa ngahambat réaksi PCR saterusna. | 1. Naha aya polusi bisa judged ku ngukur rasio A260 / A280 jeung A260 / A230 atawa RNA éléktroforésis.2. Naha cDNA diluted nurutkeun rasio nu tangtu sanggeus transkripsi sabalikna. |
| B. Desain primér teu bener | Primer teu anneal éfisién | Pariksa primers pikeun primer-dimer atawa hairpins, mismatches, sarta kadangkala ngawengku desain intronic. |
| C. Desain program réaksi PCR teu bener | 1. Primers teu bisa éféktif anneal2. Kurangna sékrési DNA polimérase 3. jangka panjang aktivitas DNA polimérase suhu luhur turun | 1. Suhu annealing leuwih luhur ti nilai TM tina Primer2. Waktu pra-denaturasi pondok teuing 3. Waktu unggal tahapan prosedur réaksina panjang teuing |
| D. Teu cukup campur réagen atawa kasalahan pipetting | Dina sistem réaksi, konsentrasi lokal komponén réaksi PCR luhur teuing atawa henteu rata, hasilna amplifikasi non-eksponénsial tina amplifikasi PCR. | |
| E. Panjang Amplicon | Panjang amplicon panjang teuing, ngaleuwihan 300bp, sareng efisiensi amplifikasi rendah | Pariksa yén panjang amplicon antara 80-300bp |
| F. Pangaruh réagen qPCR | Konsentrasi DNA polimérase dina réagen rendah atanapi konsentrasi ion dina panyangga henteu dioptimalkeun, nyababkeun kagiatan énzim Taq henteu ngahontal maksimal. | Penentuan efisiensi amplifikasi ku kurva standar |
2.Range nilai Ct
Nilai Ct dibasajankeun 15-35.Upami nilai Ct kirang ti 15, éta dianggap yén amplifikasi aya dina kisaran periode dasar sareng ambang fluoresensi teu acan ngahontal.Ideally, aya hubungan linier antara nilai Ct jeung logaritma angka salinan awal template, nyaeta, kurva baku.Ngaliwatan kurva baku, nalika efisiensi amplifikasi nyaeta 100%, nilai Ct diitung keur quantifying jumlah salinan tunggal gén sabudeureun 35. Lamun leuwih gede ti 35, jumlah salinan awal template téoritis kirang ti 1, nu bisa dianggap euweuh hartina.
Pikeun rentang gén Ct béda, alatan béda dina jumlah salinan gén jeung efisiensi amplifikasi dina jumlah template awal, perlu nyieun kurva baku pikeun gén jeung ngitung rentang deteksi linier gén.
3. Faktor pangaruh tina nilai Ct
Tina hubungan antara jumlah siklus amplifikasi jeung jumlah produk: jumlah produk amplified = jumlah template awal × (1 + En) angka siklus, bisa ditempo yén dina kaayaan idéal, jumlah template awal jeung En bakal boga dampak negatif kana nilai Ct.Beda dina kualitas template atanapi efisiensi amplifikasi bakal ngabalukarkeun nilai Ct badag teuing atawa leutik teuing.
4.Nilai Ct badag teuing atawa leutik teuing
waktos pos: Feb-22-2023
