PCR mangrupikeun téknologi amplifikasi asam nukléat anu paling seueur dianggo sareng seueur dianggo kusabab sensitipitas sareng spésifisitasna.Tapi, PCR butuh denaturasi termal anu terus-terusan sareng teu tiasa ngaleungitkeun watesan ngandelkeun alat sareng alat, anu ngabatesan aplikasina dina uji lapangan klinis.

Ti mimiti taun 1990-an, seueur laboratorium mimiti ngembangkeun téknologi amplifikasi suhu konstan anu henteu meryogikeun denaturasi termal.Ayeuna aranjeunna parantos ngembangkeun téknologi amplifikasi isothermal anu dimédiasi ku loop, téknologi amplifikasi isothermal ngagantian untaian, téknologi amplifikasi isothermal bunderan, sareng gumantungna runtuyan asam nukléat.Téknologi amplifikasi Isothermal sareng téknologi sanés. 

Lamplifikasi isotermal dimédiasi oop

Prinsip amplifikasi dumasar kana kanyataan yén DNA aya dina kaayaan kasaimbangan dinamis kira-kira 65°C.Nalika aya primer anu dipasangkeun-basa sareng diperpanjang ka bagian pelengkap DNA untai ganda, untaian anu sanés bakal disosiasi sareng janten untaian tunggal.

Dina suhu ieu, DNA ngagunakeun 4 primer husus pikeun ngandelkeun polimérase DNA strand-displacement sangkan sintésis DNA strand-displacement ngiderkeun diri terus-terusan.

Tangtukeun heula 6 daérah spésifik F3, F2, F1, B1, B2, B3 dina gén udagan, teras rancang 4 primer dumasar kana 6 daérah spésifik ieu (sapertos dina gambar di handap ieu):

Primer batin maju (FIP) diwangun ku F1c jeung F2.

Primer batin mundur (BIP) diwangun ku B1c sareng B2, sareng TTTT dianggo salaku spacer di tengah.

Primer luar F3 jeung B3 masing-masing diwangun ku wewengkon F3 jeung B3 dina gén target.

Dina sistem réaksi LAMP, konsentrasi primer jero sababaraha kali tina primer luar.Primer jero mimitina digabungkeun jeung untaian citakan pikeun nyintésis untaian pelengkap pikeun ngabentuk untaian ganda DNA.Salajengna, primer luar digabungkeun sareng untaian citakan pikeun ngabentuk untaian ganda DNA.Dina aksi BstDNA polimérase, untaian komplementer anu disintésis ku primer batin dileupaskeun.Saatos sababaraha réaksi, untaian komplementer tungtungna ngabentuk untaian DNA tunggal sareng struktur dumbbell.

Untai tunggal DNA struktur dumbbell sorangan dipaké salaku citakan pikeun terus ngabentuk DNA struktur loop-loop transisi kalayan tungtung kabuka.Primer jero jeung luar nungtun DNA struktur gelung-gelung transisi pikeun terus-terusan ngalaman pamindahan untaian jeung réaksi penyuluhan, sarta ahirna ngabentuk sababaraha struktur gelung-gelung anu panjangna béda.campuran DNA.

Kaunggulan jeung kalemahan amplifikasi isothermal loop-dimédiasi

Keunggulan LAMP:

(1) Efisiensi amplifikasi anu luhur, anu sacara efektif tiasa ngagedékeun 1-10 salinan gén target dina 1 jam, sareng efisiensi amplifikasi nyaéta 10-100 kali PCR biasa.

(2) Waktu réaksi pondok, spésifisitasna kuat, sareng teu aya alat khusus anu diperyogikeun.

Kekurangan LAMP:

(1) Sarat pikeun primers utamana tinggi.

(2) Produk amplified teu bisa dipaké pikeun kloning na sequencing, tapi ngan bisa dipaké pikeun judgment.

(3) Kusabab sensitipitas anu kuat, gampang ngabentuk aerosol, nyababkeun positip palsu sareng mangaruhan hasil tés.

Samplifikasi pamindahan trand

Strand displacement amplification (SDA) nyaéta téknik amplifikasi DNA isothermal in vitro dumasar kana réaksi énzimatik anu munggaran diajukeun ku sarjana Amérika Walker taun 1992.

Sistem dasar SDA ngawengku endonuklease restriksi, polimérase DNA kalayan aktivitas pamindahan untai, dua pasang primer, dNTP, jeung ion kalsium jeung magnésium jeung sistem panyangga.

Prinsip amplifikasi strand displacement dumasar kana réstriksi kimiawi réstriksi éndonuclease sekuen pangakuan dina kadua tungtung DNA target.Endonuclease ngabuka celah dina untaian DNA dina situs pangakuanna, sarta DNA polimérase ngalegaan celah 3′ End jeung ngagantikeun untaian DNA salajengna.

Untai tunggal DNA anu diganti tiasa digabungkeun sareng primer sareng diperpanjang janten untaian ganda ku DNA polimérase.Prosés ieu terus-terusan terus-terusan, supados sekuen udagan éfisién digedékeun.

Kaunggulan jeung kalemahan tina téhnologi amplifikasi strand displacement

Keunggulan SDA:

Efisiensi amplifikasi tinggi, waktos réaksi pondok, spésifisitasna kuat, sareng teu aya alat khusus anu diperyogikeun.

Kelemahan SDA:

Produkna henteu seragam, sareng sababaraha produk tunggal-terdampar sareng ganda-terdampar sok diproduksi dina siklus SDA, sareng tailing bakal kajantenan nalika dideteksi ku éléktroforésis.

Ramplifikasi lingkaran olling

Rolling circle amplification (RCA) diajukeun ku cara ngagambar kana métode nyalin DNA tina organisme patogén ku rolling circle.Ieu nujul kana pamakéan single-stranded sirkular DNA salaku citakan dina suhu konstan, sarta polimérase DNA husus (kayaning Phi29) ) Dina aksi sintésis DNA bunderan rolling pikeun ngahontal Gedekeun tina gén target.

RCA tiasa dibagi kana amplifikasi linier sareng amplifikasi eksponensial.Efisiensi linier RCA tiasa ngahontal 10⁵kali, sarta efisiensi RCA eksponensial bisa ngahontal 10⁹kali.

Bédana basajan, sakumaha ditémbongkeun dina gambar di handap, amplifikasi linier a ngan ngagunakeun 1 primer, amplifikasi eksponensial b boga 2 primers.

RCA linier disebut oge RCA primer tunggal.Primer ngabeungkeut DNA sirkular sarta diperpanjang ku aksi DNA polimérase.Produkna mangrupikeun untaian tunggal linier kalayan sajumlah ageung urutan repetitive rébuan kali panjang loop tunggal.

Kusabab produk linier RCA sok disambungkeun ka Primer mimiti, fiksasi gampang sinyal mangrupa kaunggulan utama.

RCA eksponensial, ogé katelah Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), dina RCA eksponensial, hiji Primer ngagedékeun produk RCA, Primer kadua hibridisasi jeung produk RCA sarta ngalegaan, sarta ngagantian geus kabeungkeut kana produk RCA Primer hilir manjangkeun untaian, sarta ngulang extension jeung ngagantian pikeun ngahasilkeun produk déndritik RCA.

Kaunggulan jeung kalemahan rolling circle asam nukléat amplifikasi

Keunggulan RCA:

Sensitipitas tinggi, spésifisitas anu saé sareng operasi anu gampang.

Kekurangan RCA:

Masalah latar tukang nalika deteksi sinyal.Salila réaksi RCA, usik padlock uncirculated jeung DNA template atawa RNA usik unbound bisa ngahasilkeun sababaraha sinyal tukang. 

Namplifikasi dumasar-urutan ucleicacid

Amplifikasi dumasar-urutan asam nukléat (NASBA) nyaéta téknologi anyar anu dikembangkeun dina dasar PCR.Ieu mangrupakeun amplifikasi asam nukléat kontinyu sarta isothermal dipandu ku sapasang primers kalawan runtuyan promoter T7.Téknologi tiasa ngagedékeun template RNA sakitar 109 kali dina waktos 2 jam, nyaéta 1000 kali langkung luhur tibatan metode PCR konvensional sareng henteu peryogi alat khusus.

Téknologi ieu parantos dianggo pikeun diagnosis gancang panyakit pas muncul, sareng seueur perusahaan ayeuna nganggo metode ieu dina kit deteksi RNA.

Sanajan amplifikasi RNA ogé bisa ngagunakeun téhnologi PCR transkripsi sabalikna, NASBA boga kaunggulan sorangan: eta bisa dilaksanakeun dina kaayaan hawa rélatif konstan, sarta éta leuwih stabil sarta akurat ti téhnologi PCR tradisional.

Réaksina aya dina 41 darajat Celsius sarta merlukeun AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase jeung sapasang primers pikeun ngalengkepan.

Prosésna utamana ngawengku:

Primer maju ngandung runtuyan pelengkap tina promoter T7.Salila réaksi, primer maju ngiket kana untaian RNA sarta dikatalisis ku énzim AMV pikeun ngabentuk untaian ganda DNA-RNA.

RNase H nyerna RNA dina untaian ganda hibrid sarta nahan DNA untai tunggal.

Dina aksi primer sabalikna sareng énzim AMV, untaian ganda DNA anu ngandung sekuen promoter T7 kabentuk.

Dina aksi T7 RNA polymerase, prosés transkripsi réngsé sareng sajumlah ageung target RNA diproduksi.

Keunggulan NASBA:

(1) Primer na boga runtuyan promoter T7, tapi DNA ganda-stranded asing teu boga runtuyan promoter T7 tur teu bisa amplified, jadi téhnologi ieu spésifisitas tinggi na sensitipitas.

(2) NASBA langsung ngasupkeun prosés transkripsi tibalik kana réaksi amplifikasi, pondok waktu réaksi.

Kelemahan NASBA:

(1) Komponén réaksina leuwih pajeulit.

(2) Tilu rupa énzim anu diperlukeun sangkan réaksi ngarugikeun leuwih luhur.