PCR, sababaraha PCR, PCR in situ, PCR ngabalikeun, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Kami bakal nyortir konsép, léngkah sareng detil rupa PCR

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, disebut PCR, mangrupikeun téknologi biologis molekular anu dianggo pikeun ngagedekeun fragmen DNA khusus.Ieu bisa dianggap salaku réplikasi DNA husus in vitro.DNA polimérase (DNA Polimérase I) kapanggih dina awal taun 1955, sarta Klenow Fragment of E. Coli, nu mibanda nilai ékspérimén jeung practicality, kapanggih ku Dr. H. Klenow dina awal taun 1970-an, tapi ku sabab énzim ieu teu toleran suhu, suhu luhur bisa degenerate eta, jadi teu minuhan réaksi ranté polymerase tinggi.Énzim anu dianggo ayeuna (disebut Taq polymerase), diisolasi tina Thermus aquaticus, baktéri cinyusu panas dina taun 1976. Cirina nyaéta yén éta tiasa tahan suhu anu luhur sareng mangrupikeun énzim anu idéal, tapi seueur dianggo saatos taun 1980-an.Konsep aslina tina prototipe primitif aslina tina PCR téh sarupa jeung perbaikan gén jeung nyalin, nu diajukeun ku Dr KJell Kleppe di 1971. Anjeunna diterbitkeun salinan gén basajan tur jangka pondok munggaran (sarupa jeung dua réaksi siklus mimiti PCR).PCR anu dikembangkeun ayeuna dikembangkeun ku Dr. Kary B. Mullis dina taun 1983. Dr. Mullis ngalayanan perusahaan PE dina taun éta, ku kituna PE ngagaduhan status khusus dina industri PCR.Dr Mullis sacara resmi medarkeun makalah anu aya hubunganana sareng Saiki sareng anu sanés dina 1985. Ti saprak éta, panggunaan PCR rébuan mil sadinten, sareng kualitas makalah anu aya hubunganana tiasa nyarios yén seueur metode panalungtikan anu henteu pikaresepeun.Salajengna, téknologi PCR seueur dianggo dina panalungtikan ilmiah biologis sareng aplikasi klinis, janten téknologi anu paling penting dina panalungtikan biologi molekular.Mullis ogé meunang Hadiah Nobel Kimia 1993.

PCRPrinsipna

Prinsip dasar téknologi PCR sarua jeung prosés réplikasi alamiah DNA, sarta spésifisitasna gumantung kana primer oligonukleotida nu pelengkap duanana tungtung runtuyan udagan.PCR diwangun ku degenerasi-annealing-manjangan tilu léngkah réaksi dasar: ①Degenerasi DNA template: Saatos DNA citakan dipanaskeun nepi ka kira 93 ° C pikeun kurun waktu nu tangtu, solusi DNA ganda pikeun DNA dual-ranté kabentuk ku amplifikasi PCR tina template DNA ninggalkeun, nyieun hiji ranté tunggal jadi bisa disiapkeun pikeun babak salajengna.②Anil (senyawa) DNA citakan sareng primer: Saatos DNA citakan dipanaskeun sareng dirobih janten ranté tunggal, suhu turun dugi ka 55°C.Urutan komplementer tina primer jeung DNA template ranté tunggal.③Perpanjangan primer: DNA template-pengikat primer dumasar kana aksi TaqDNA polymerase, kalawan dNTP salaku bahan baku réaksi.Tetep prinsip réplikasi, nyintésis ranté salinan semi-ditangtayungan anyar nu ngalengkepan ranté DNA template, sarta siklus ulang degeneration-annealing-ekstensi tilu prosés bisa meunang leuwih "ranté salinan semi-ditangtayungan", sarta ranté anyar ieu sadia deui jadi template pikeun siklus salajengna.Butuh 2-4min pikeun ngarengsekeun loop, gén target tiasa diamplifikasi sababaraha juta kali dina 2-3 jam.

StandarPCRSistem Réaksi

Lima unsur réaksi PCR

Utamana aya lima rupa zat anu aub dina réaksi PCR, nyaéta primer, énzim, dNTP, citakan sareng panyangga (Mg2+ diperyogikeun).[Prosedur PCR]

Prosés PCR standar dibagi kana tilu léngkah

1. Degenerasi DNA (90 ° C-96 ° C): Témplat DNA ranté ganda dina aksi termal, beungkeut hidrogén megatkeun, ngabentuk DNA ranté tunggal.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Suhu sistem diréduksi, Primer digabungkeun jeung témplat DNA pikeun ngabentuk dual-ranté lokal.

3. Extension (70 ℃ -75 ℃): Dina aksi énzim Taq (kira-kira 72 ° C, kagiatan pangalusna), dNTP dipaké salaku bahan baku, ngalegaan ti tungtung 5′ Primer → 3′ tungtung, sintésis jeung template pelengkap silih ranté DNA.

Unggal siklus didenaturasi, dianil sareng diperpanjang, ngagandakeun eusi DNA.Ayeuna, alatan wewengkon amplifikasi pondok, sababaraha PCR bisa replicated dina waktu anu pohara pondok sanajan aktivitas énzim Taq teu optimal, jadi bisa dirobah jadi dua hambalan, nyaeta, annealing jeung extension bisa dipigawé dina 60 ° C-65 ° C dina waktos anu sareng.Dina raraga ngurangan prosés ngangkat jeung cooling sarta ngaronjatkeun laju respon.

Fitur Réaksi PCR

● High-Spésifik

Faktor penentu spésifik tina réspon PCR nyaéta: ①Kombinasi spésifik tina primer sareng DNA citakan.②Prinsip papasangan basa.③Kasatiaan réaksi sintésis polimérase TaqDNA.④Spésifisitas sareng konservatif gén target.

Kombinasi anu leres tina primer sareng témplat mangrupikeun konci.Beungkeutan tina Primer jeung citakan jeung perluasan ranté Primer dumasar kana prinsip cocog basa basa.Kasatiaan réaksi sintésis polimérase sareng résistansi suhu luhur tina polimérase DNA Taq pikeun ngajantenkeun beungkeutan (sanyawa) citakan sareng primer dina réaksi tiasa dilaksanakeun dina suhu anu langkung luhur.spésifisitas kombinasi ieu greatly ngaronjat.Klip tiasa ngajaga tingkat akurasi anu luhur.Ku milih wewengkon genetik sasaran kalawan konservatif tinggi jeung konservatif tinggi, spésifisitas na leuwih luhur.

● Sensitipitas High

Volume produksi produk PCR ngaronjat ku indéks, nu bisa ngalegaan template awal Picker (PG=10-12) pikeun ngaronjatkeun tingkat mikrokontroler ka tingkat micrograms (μg= -6).Sél target tiasa dideteksi tina 1 juta sél;dina deteksi virus, sensitipitas PCR tiasa ngahontal 3 RFUs (titik kosong kabentuk unit);laju deteksi minimum dina élmu baktéri nyaéta 3 baktéri.

● Basajan jeung Gancang

Pantulan PCR ngagunakeun suhu tinggi Taq DNA polymerase, anu nambihan solusi réaksi dina hiji waktos, nyaéta réaksi degenerasi-anneal-extension dina solusi amplifikasi DNA sareng pot mandi cai.Sacara umum, réaksi amplifikasi réngsé dina 2 dugi ka 4 jam.produk Augmented umumna dianalisis ku pedang listrik, sarta teu kudu make isotop, euweuh polusi radioaktif, sarta promosi gampang.

● The purity of specimen nyaeta low

Teu perlu misahkeun virus atawa baktéri jeung sél kultur.Produk kasar DNA sareng RNA tiasa dianggo salaku amplifier.Deteksi amplifikasi DNA tiasa dianggo langsung nganggo spésimén klinis sapertos getih, cairan awak, cairan cuci batuk, rambut, sél, sareng jaringan hirup.

PCRmasalah umum

● Palsu négatip, euweuh pita amplified

Tahap konci réaksi PCR ngawengku: ① persiapan asam nukléat citakan, ② kualitas jeung spésifisitas primers, ③ kualitas énzim ④ kaayaan siklus PCR.Milarian alesanana ogé kedah dianalisis sareng ditaliti pikeun tautan di luhur.

Citakan: ① Citakan ngandung rupa-rupa protéin, ② Citakan ngandung inhibitor énzim Taq, ③ Protéin dina citakan teu dileungitkeun, utamana protéin golongan dina kromosom.⑤ Degenerasi asam nukléat Deminer henteu tuntas.Nalika kualitas énzim sareng primer saé, henteu aya pita amplifikasi, anu paling dipikaresep mangrupikeun perlakuan pencernaan spésimén.Aya anu lepat sareng prosés ékstraksi asam nukléat citakan, janten pikeun nyiapkeun solusi nyerna anu efektif sareng stabil, prosedurna kedah dibenerkeun sareng henteu sawenang-wenang dirobih.

Inactivation énzim: énzim anyar atawa duanana énzim heubeul jeung anyar kudu dipake babarengan pikeun nganalisis naha aktivitas énzim leungit atawa cukup, ngarah kana négatip palsu.Perlu dicatet yén énzim Taq atanapi etidium bromida kadang-kadang hilap.

Primer: kualitas primer, konsentrasi primer, jeung naha konsentrasi dua primers simetris.Ieu mangrupikeun alesan umum pikeun gagalna PCR atanapi pita ningkatna henteu idéal sareng rawan kasebar.Aya masalah sareng kualitas primers sababaraha nomer bets.Dua primers boga konsentrasi luhur sarta konsentrasi low, ngabalukarkeun low -efficiency amplifikasi asimétri.Penanggulangan nyaéta: ① Pilih primer anu saé pikeun nyintésis unit.② Konsentrasi Primer henteu ngan gumantung kana nilai OD, tapi ogé nengetan cairan aslina Primer pikeun nyieun agar gula gél Éléktroforésis.Kedah aya zona strip primer, sareng kacaangan dua primer kedah umumna konsisten.Sabuk, PCR tiasa gagal dina waktos ieu, sareng éta kedah direngsekeun ku unit sintésis primer.Upami primerna luhur, kacaanganna rendah, sareng konsentrasina kedah saimbang nalika éncér.③ Primer kudu dibayar jeung disimpen dina konsentrasi luhur pikeun nyegah sababaraha katirisan atawa bagian refrigeration jangka panjang tina kulkas, nu bakal ngakibatkeun deteriorate jeung degradasi Primer.④ Desain primer teu masuk akal, sapertos panjang primer henteu cekap, sareng kluster di kabentuk antara primer.

Konsentrasi Mg2 +: Konsentrasi ion Mg2 + gaduh dampak anu ageung kana efisiensi amplifikasi PCR.Konsentrasi kaleuleuwihan bisa ngurangan lawan jenis tina amplifikasi PCR.Upami konsentrasina rendah teuing, kaluaran amplifikasi PCR malah bakal ngajantenkeun gagalna amplifikasi PCR tanpa pita ékspansi.

Parobihan volume réaksi: Volume anu dianggo dina amplifikasi PCR nyaéta 20ul, 30ul, sareng 50ul atanapi 100uL, volume ageung aplikasi pikeun amplifikasi PCR diatur dumasar kana tujuan anu béda pikeun panalungtikan ilmiah sareng uji klinis.Sanggeus nyieun jilid leutik kayaning 20ul, perlu nyieun kaayaan ari nalika nyieun ukuran, disebutkeun eta bakal gagal.

Alesan fisik: Transformasi penting pisan pikeun amplifikasi PCR.Lamun hawa degeneration low, waktos degeneration pondok, éta kamungkinan lumangsung dina negatives palsu;hawa annealing teuing low bisa ngabalukarkeun amplifikasi non-spésifik sarta ngurangan efisiensi amplifikasi husus.Kacida mangaruhan kombinasi primers na template pikeun ngurangan efisiensi amplifikasi PCR.Kadang-kadang perlu ngagunakeun térmométer standar pikeun ngadeteksi variabilitas, annealing sareng suhu anu diperpanjang dina penyuluhan atanapi kompor larut cai, anu mangrupikeun salah sahiji alesan pikeun gagalna PCR.

Varian runtuyan udagan: Lamun runtuyan udagan lumangsung, mutasi atawa ngahapus, kombinasi prototipe jeung citakan digabungkeun, atawa alatan kurangna runtuyan udagan, primer jeung citakan bakal leungit runtuyan pelengkap, sarta amplifikasi PCR na moal suksés.

● positip palsu

Pita amplifikasi PCR katingalina konsisten sareng pita sekuen target, sareng kadang pitana langkung rapih sareng langkung luhur.

Desain Primer teu luyu: runtuyan amplifikasi dipilih jeung runtuyan amplifikasi non-tujuan boga homolog, jadi lamun amplifikasi PCR, produk PCR amplified mangrupakeun urutan non-purposeful.Runtuyan target pondok teuing atawa primer teuing pondok, sarta eta rawan positif palsu.Perlu didesain ulang.

Polusi silang tina runtuyan udagan atawa produk amplifikasi: Aya dua alesan pikeun polusi ieu: Kahiji, polusi silang sakabéh génom atawa bagéan badag, ngarah kana positip palsu.Jenis positip palsu ieu tiasa direngsekeun ku cara-cara di handap ieu: Ati-ati sareng lemah lembut nalika operasi pikeun nyegah sekuen udagan diseuseup kana bedil sampel atanapi cipratan kaluar tina tabung centrifugal.Kacuali énzim sareng zat anu henteu tahan suhu anu luhur, sadaya réagen atanapi alat kedah disinfeksi kalayan tekanan anu luhur.Pipa centrifugal sareng conto kedah dianggo sakaligus.Lamun perlu, saméméh nambahkeun spésimén, tabung réaksi jeung réagen kakeunaan sinar ultraviolét pikeun ngancurkeun asam nukléat aya.Kadua, fragmen leutik dina polusi udara.Ieu fragmen leutik leuwih pondok ti runtuyan sasaran, tapi maranéhna mibanda homologi tangtu.Ieu bisa spliced ​​saling.Saatos ngalengkepan primers, produk PCR tiasa dilegakeun, anu bakal nyababkeun produksi positip palsu.Éta tiasa dianggo pikeun ngirangan atanapi ngaleungitkeun metode PCR sayang.

● Nembongan pita amplifikasi nonspésifik

Pita anu muncul saatos amplifikasi PCR henteu konsisten sareng ukuran anu dipiharep, atanapi ageung atanapi alit, atanapi dina waktos anu sami, atanapi dina waktos anu sami, pita amplifikasi khusus sareng pita amplifikasi non-spésifik.Munculna pita non-spésifik nyaéta: Kahiji, primers teu lengkep pelengkap runtuyan target, atawa polimérisasi primer pikeun ngabentuk di cluster.Anu kadua nyaéta konsentrasi ion MG2 + teuing tinggi, suhu annealing rendah teuing, sareng jumlah siklus PCR aya hubunganana.Kadua, kualitas sareng jumlah énzim.Seringna, énzim tina sababaraha sumber rawan kana pita non-spésifik sareng énzim sumber sanésna henteu kajantenan.Kadangkala amplifikasi non-spésifik énzim ogé lumangsung.The countermeasures nyaeta: ulang dirancang pikaresepeun lamun perlu.Ngurangan jumlah énzim atawa ngaganti énzim sumber séjén.Ngurangan jumlah primér, ningkatkeun jumlah template appropriately, sarta ngurangan jumlah siklus.Leres ningkatkeun suhu annealing atanapi nganggo metode dua titik suhu (93 ° C degenerasi, annealing sareng ngalegaan sakitar 65 ° C).

● Muncul flaky ngerek atawa smear tape

Amplifikasi PCR kadang sigana diterapkeun atanapi dilapis atanapi sabuk sapertos karpét.Ku sabab kitu, alatan jumlah kaleuleuwihan énzim atawa kualitas goréng énzim, konsentrasi dNTP teuing tinggi, konsentrasi Mg2 + teuing tinggi, suhu annealing teuing low, sarta jumlah siklus teuing.Penanggulangan nyaéta: ① Ngurangan jumlah énzim, atanapi ngarobih énzim sumber sanés.②Turunkeun konsentrasi dNTP ③Kurangkeun konsentrasi Mg2+ anu leres.④Ningkatkeun kuantitas témplat sareng ngirangan jumlah siklus.

Produk patali

PCR Heroᵀᴹ (Kalayan Pewarna)

◮ Kasatiaan anu langkung luhur: 6 kali lipat tina énzim Taq biasa;

◮ Laju amplifikasi langkung gancang

◮ Langkung adaptasi template

◮ Efisiensi amplifikasi anu langkung luhur

◮ Toleransi lingkungan leuwih kuat: disimpen dina 37 ° C salila saminggu, ngajaga leuwih ti 90% aktivitas;

◮ Mibanda aktivitas polimérase DNA 5'→3' jeung aktivitas exonuclease 5'→3', tanpa aktivitas exonuclease 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (Kalayan Pewarna)

Sistem réaksi unik sareng efisiensi tinggi Taq DNA Polymerase ngajantenkeun réaksi PCR gaduh efisiensi amplifikasi, spésifisitas sareng sensitipitas anu langkung luhur.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Salah Lengkah)-SYBR Green I

◮ One-step kit ngajadikeun transkripsi sabalikna sareng qPCR dua réaksi dina tabung anu sami, ngan ukur kedah nambihan template RNA, primer PCR khusus sareng ddH Bebas RNase₂O.

◮ Kit tiasa gancang sareng éfisién sacara kuantitatif nganalisis RNA virus atanapi ngalacak RNA.

◮ Kit ngagunakeun réagen transkripsi sabalikna Foregene anu unik sareng Foregene HotStar Taq DNA Polymerase digabungkeun sareng sistem réaksi anu unik pikeun sacara efektif ningkatkeun efisiensi amplifikasi sareng spésifisitas réaksina.

◮ Sistem réaksi anu dioptimalkeun ngajadikeun réaksina gaduh sensitipitas deteksi anu langkung luhur, stabilitas termal anu langkung kuat, sareng kasabaran anu langkung saé.

◮ RT-qPCR Gampang^TM(Salah Lengkah) -SYBR Héjo I kit hadir kalawan ROX ngalelep rujukan internal, nu bisa dipaké pikeun ngaleungitkeun tukang sinyal jeung sinyal kasalahan antara sumur, nu merenah pikeun konsumén ngagunakeun dina model béda tina instrumen PCR kuantitatif.

RT Gampang^TMII (Master Premix pikeun kahiji-strand sintésis cDNA pikeunPCR waktos nyata)

-Kamampuhan efisien ngaleupaskeun gDNA, nu bisa nyabut gDNA dina citakan dina 2 menit.

-Sistem transkripsi sabalikna anu efisien, ngan ukur peryogi 15 menit pikeun ngarengsekeun sintésis cDNA untaian munggaran.

-Templat kompléks: témplat kalawan eusi GC tinggi jeung struktur sekundér kompléks ogé bisa dibalikkeun kalawan efisiensi tinggi.

-Sistem transkripsi sabalikna sensitipitas luhur, témplat tingkat pg ogé tiasa nampi cDNA kualitas luhur.

-Sistem transkripsi sabalikna gaduh stabilitas termal anu luhur, suhu réaksi anu optimal nyaéta 42 ℃, sareng éta masih gaduh kinerja transkripsi sabalikna anu saé dina 50 ℃.