PCR (réaksi ranté polimérase) nyaéta salah sahiji téknologi amplifikasi DNA in-vitro, kalayan sajarahna leuwih ti 30 taun.

Téknologi PCR dipelopori ku Kary Mullis ti Cetus, AS dina taun 1983. Mullis ngalamar patén PCR di 1985 sarta medalkeun makalah akademik PCR munggaran ngeunaan Science dina taun anu sarua.Mullis dilélér Hadiah Nobel Kimia dina 1993 pikeun karyana.

Prinsip Dasar PCR

PCR tiasa ngagedékeun fragmen DNA target ku langkung ti sajuta kali.Prinsipna aya dina katalisis DNA polimérase, ngagunakeun DNA untaian induk salaku citakan sareng primer khusus salaku titik awal pikeun ekstensi.Ieu replicated in vitro ngaliwatan léngkah kayaning denaturation, annealing, sarta extension.Prosés DNA untai putri pelengkap DNA untaian induk template.

Prosés PCR standar dibagi kana tilu léngkah:

1.Denaturation: Paké suhu luhur pikeun misahkeun untaian ganda DNA.Beungkeut hidrogén antara untaian ganda DNA pegat dina suhu luhur (93-98 ℃).

2.Annealing: Saatos DNA untai ganda dipisahkeun, nurunkeun suhu supados primer tiasa ngabeungkeut DNA untaian tunggal.

3. Extension: DNA polimérase mimiti nyintésis untaian komplementer sapanjang untaian DNA tina primers kabeungkeut nalika suhu diturunkeun.Nalika extension geus réngsé, siklus geus réngsé, sarta jumlah fragmen DNA ganda

Malikkeun tilu léngkah ieu 25-35 kali, jumlah fragmén DNA bakal ningkat sacara éksponénsial.

Kacerdasan PCR nyaéta yén primer anu béda-béda tiasa dirarancang pikeun gén udagan anu béda, ku kituna fragmen gén target tiasa diamplifikasi dina waktos anu pondok.

Sajauh ieu, PCR tiasa dibagi kana tilu kategori, nyaéta PCR biasa, PCR kuantitatif fluoresensi sareng PCR digital.

Generasi kahiji PCR biasa

Anggo alat amplifikasi PCR biasa pikeun ngagedékeun gén target, teras nganggo éléktroforésis gél agarose pikeun ngadeteksi produk, ngan ukur analisa kualitatif anu tiasa dilakukeun.

Karugian utama PCR generasi kahiji:

1.Prone kana Gedekeun non-spésifik jeung hasil positif palsu.

2.The deteksi nyokot lila tur operasi téh bagong.

3. Ngan ukur tés kualitatif anu tiasa dilakukeun

Generasi kadua Real-Time PCR

Real-Time PCR, ogé katelah qPCR, ngagunakeun panyilidikan fluoresensi nu bisa nunjukkeun kamajuan sistem réaksi, sarta ngawas akumulasi produk amplified ngaliwatan akumulasi sinyal fluoresensi, sarta hakim hasil ngaliwatan kurva fluoresensi.Éta tiasa diukur kalayan bantosan nilai Cq sareng kurva standar.

Kusabab téknologi qPCR dilaksanakeun dina sistem katutup, kamungkinan kontaminasi diréduksi, sareng sinyal fluoresensi tiasa diawaskeun pikeun deteksi kuantitatif, ku kituna éta paling seueur dianggo dina prakték klinis sareng parantos janten téknologi dominan dina PCR.

Zat fluoresensi dipaké dina PCR kuantitatif fluoresensi real-time bisa dibagi kana: TaqMan usik fluoresensi, beacons molekular jeung ngalelep fluoresensi.

1) TaqMan usik fluoresensi:

Salila amplifikasi PCR, usik fluoresensi husus ditambahkeun bari nambahkeun sapasang primer.Panyilidikan mangrupa oligonukleotida, sarta duanana tungtung dilabélan ku gugus fluoresensi reporter jeung grup fluoresensi quencher.

Nalika usik gembleng, sinyal fluoresensi dipancarkeun ku grup reporter kaserep ku grup quenching;salila amplifikasi PCR, aktivitas exonuclease 5′-3′ énzim Taq cleaves jeung degrades usik, nyieun reporter group fluoresensi jeung quencher Grup fluoresensi dipisahkeun, jadi sistem ngawaskeun fluoresensi bisa narima sinyal fluoresensi, nyaeta, unggal waktu strand DNA ieu amplified lengkep, formasi fluoresensi fluoresensi, jeung molekul ieu akumulasi fluoresensi. produk PCR.

2) SYBR pewarna fluoresensi:

Dina sistem réaksi PCR, kaleuwihan ngalelep fluoresensi SYBR ditambahkeun.Saatos pewarna fluoresensi SYBR henteu sacara khusus diasupkeun kana untaian ganda DNA, éta ngaluarkeun sinyal fluoresensi.Molekul pewarna SYBR anu henteu diasupkeun kana ranté moal ngaluarkeun sinyal fluoresensi, ku kituna mastikeun sinyal fluoresensi Kanaékan produk PCR lengkep disingkronkeun sareng paningkatan produk PCR.SYBR ukur ngabeungkeut DNA untaian ganda, jadi kurva lebur bisa dipaké pikeun nangtukeun naha réaksi PCR husus.

3) lantera molekular:

Éta mangrupikeun panyilidikan oligonukleotida anu dilabélan ganda-loop anu ngawangun struktur jepit rambut sakitar 8 basa dina 5 sareng 3 tungtung.Runtuyan asam nukléat dina duanana tungtung téh complementarily dipasangkeun, ngabalukarkeun grup fluoresensi jeung gugus quenching jadi ketat.Tutup, euweuh fluoresensi bakal dihasilkeun.

Saatos produk PCR dihasilkeun, salila prosés annealing, bagian tengah lantera molekular dipasangkeun jeung runtuyan DNA husus, sarta gén fluoresensi dipisahkeun tina gén quencher pikeun ngahasilkeun fluoresensi.

Karugian utama PCR generasi kadua:

Sensitipitas masih kurang, sarta deteksi spésimén low-salinan teu akurat.

Aya pangaruh tina nilai latar, sarta hasilna rentan ka gangguan.

Nalika aya sambetan PCR dina sistem réaksi, hasil deteksi rentan ka gangguan.

PCR digital generasi katilu

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ngitung jumlah salinan tina runtuyan target ngaliwatan deteksi titik tungtung, sarta bisa ngalakukeun deteksi kuantitatif mutlak akurat tanpa ngagunakeun kadali internal tur kurva baku.

PCR digital ngagunakeun deteksi titik-tungtung sareng henteu gumantung kana nilai Ct (ambang siklus), janten réaksi PCR digital kirang kapangaruhan ku efisiensi amplifikasi, sareng kasabaran kana sambetan réaksi PCR ningkat, kalayan akurasi sareng reproducibility anu luhur.

Kusabab karakteristik sensitipitas anu luhur sareng akurasi anu luhur, éta henteu gampang diganggu ku sambetan réaksi PCR, sareng éta tiasa ngahontal kuantitas mutlak anu leres tanpa produk standar, anu parantos janten hotspot panalungtikan sareng aplikasi.

Nurutkeun kana bentuk béda tina Unit réaksi, éta bisa dibagi kana tilu tipe utama: microfluidic, chip sarta sistem droplet.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Dumasar kana téknologi microfluidic, témplat DNA dipisahkeun.Téknologi microfluidic tiasa ngawujudkeun sampel nano-upgrading atanapi generasi ogé titik-titik leutik, tapi ogé titik-titik perlu metoda adsorption husus lajeng digabungkeun jeung sistem réaksi PCR.mdPCR geus laun geus diadopsi ku métode séjén ngaganti.

2) PCR digital berbasis droplet, ddPCR:

Anggo téknologi generasi tetesan cai-dina-minyak pikeun ngolah sampel jadi titik-titik, sareng ngabagi sistem réaksi anu ngandung molekul asam nukléat kana rébuan tetes skala nano, anu masing-masing henteu ngandung molekul udagan asam nukléat pikeun dideteksi, atanapi Ngandung hiji nepi ka sababaraha molekul udagan asam nukléat pikeun diuji.

3) PCR digital berbasis chip, cdPCR:

Anggo téknologi jalur cairan terpadu pikeun ngukir seueur microtubes sareng microcavities dina wafer silikon atanapi gelas kuarsa, sareng ngontrol aliran solusi ngalangkungan klep kontrol anu béda, sareng ngabagi cairan sampel kana nanométer ukuran anu sami kana sumur réaksi pikeun Réaksi PCR digital pikeun ngahontal kuantitas mutlak.

Karugian utama PCR generasi katilu:

Parabot sareng réagenna mahal.

Sarat kualitas template anu luhur.Lamun kuantitas citakan ngaleuwihan kuantitas microsystem, éta moal mungkin keur ngitung, sarta lamun éta leutik teuing, akurasi quantification bakal ngurangan.

Positip palsu ogé bisa dihasilkeun nalika aya amplifikasi non-spésifik.