COVID-19 mangrupikeun panyakit tepa anu disababkeun ku Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus Tipe 2. Nalika hiji jalma katépaan, gejala anu paling umum kalebet muriang, batuk, sareng sesak napas.

Sampel anu digunakeun pikeun nguji tiasa dikumpulkeun ku swab nasopharyngeal atanapi swab oropharyngeal.

Naon PCR?

Metodeu standar pikeun deteksi coronavirus nyaéta réaksi ranté polimérase, PCR.Ieu métode loba dipaké dina biologi molekular.Bisa gancang nyalin jutaan nepi ka milyaran fragmen DNA husus.

Koronavirus anyar ngandung génom RNA untaian tunggal anu panjang pisan.Pikeun ngadeteksi virus ieu ku PCR, molekul RNA kudu dirobah jadi runtuyan DNA komplementer ku transcriptase balik, lajeng DNA nu anyar disintésis bisa diamplified ku prosedur PCR baku, nu ilahar disebut RT-PCR.

prosés RT-PCR

ékstraksi RNA

Pikeun ngalaksanakeun metode ieu, RNA virus dasarna kedah diekstrak.Rupa-rupa kit purifikasi RNA tiasa dianggo pikeun pamisahan anu gampang, gancang sareng efektif.

Pikeun nimba RNA viral maké kit komérsial, mimitina nambahkeun sampel kana tube microcentrifuge lajeng campur jeung panyangga lysis.panyangga ieu kacida denatured sarta biasana diwangun ku fénol jeung guanidine isothiocyanate.Salaku tambahan, sambetan RNase biasana aya dina panyangga lisis pikeun mastikeun isolasi RNA virus anu utuh.

Saatos nambahkeun panyangga lysis, vortex tube Pergaulan ku pulsa na incubate dina suhu kamar.Virus ieu lajeng dilisiskeun dina kaayaan denaturasi pisan anu disayogikeun ku panyangga lisis.

Saatos sampel dilisekeun, tabung centrifuge dianggo pikeun prosedur purifikasi.Sampel ieu dimuat kana tube centrifuge lajeng centrifuged.

Prosedur ieu mangrupa métode ékstraksi fase padet nu fase stasioner diwangun ku matriks gél silika.

Dina kaayaan uyah jeung pH optimal, molekul RNA ngabeungkeut mémbran silika.

Dina waktos anu sami, protéin sareng rereged sanésna dipiceun.

Saatos sentrifugasi, nempatkeun tabung centrifuge kana tabung koleksi bersih, piceun filtrate, teras tambahkeun panyangga cuci.

Teundeun tabung dina centrifuge deui pikeun maksakeun nyeuseuh panyangga ngaliwatan mémbran.Ieu bakal miceun sagala najis sésana tina mémbran, ngan nyésakeun RNA kabeungkeut kana gél silika.

Saatos sampel dikumbah, nempatkeun tabung kana tube microcentrifuge beresih jeung tambahkeun panyangga élusi.

Ieu lajeng centrifuged maksakeun panyangga élusi ngaliwatan mémbran.Panyangga élusi ngaluarkeun RNA virus tina kolom spin sareng kéngingkeun RNA anu dimurnikeun tanpa protéin, inhibitor, sareng kontaminan sanés.

Léngkah 2

Konsentrasi campuran

Saatos ékstrak RNA virus, léngkah satuluyna nyaéta nyiapkeun campuran réaksi pikeun amplifikasi PCR.Dina tahap ieu, konsentrasi dipaké.Leyuran kentel ieu mangrupa leyuran kentel premixed diwangun ku hiji premix, reverse transcriptase, nukléotida, maju primer, reverse primer, TaqMan usik jeung DNA polymerase.

Tungtungna, pikeun ngalengkepan campuran réaksi ieu, citakan RNA ditambahkeun.Tabung dicampur ku vortexing pulsa, lajeng campuran réaksi ieu dimuat kana piring PCR.Plat PCR biasana ngandung 96 sumur sareng tiasa nganalisis sababaraha conto dina waktos anu sami.

Léngkah 3

amplifikasi PCR

Salajengna, nempatkeun piring dina mesin PCR, nu dasarna mangrupa cycler termal.

RT-PCR sacara real-time dianggo pikeun ngadeteksi novel coronavirus 2019 ku cara ngagedékeun sekuen target dina gén RdrRP, gén E sareng gén N.Pilihan gén target gumantung kana urutan primér sarta usik.

Léngkah munggaran tina RT-PCR nyaéta transkripsi balik.Untaian kahiji DNA komplementer disintésis, anu diprakarsai ku PCR reverse primer, anu ngabeungkeut bagian komplementer tina génom RNA virus.Lajeng reverse transcriptase nambahkeun nukléotida DNA kana 3′ tungtung primer pikeun sintésis DNA pelengkap RNA viral.Suhu sareng lilana léngkah ieu gumantung kana primers, target RNA, sareng reverse transcriptase anu dianggo.

Salajengna, léngkah denaturasi awal diterapkeun, anu nyababkeun denaturasi hibrida RNA-DNA.Léngkah ieu diperlukeun pikeun ngaktipkeun DNA polimérase.Dina waktos anu sami, reverse transcriptase dinonaktipkeun.

PCR diwangun ku runtuyan siklus termal.Unggal siklus diwangun ku denaturasi, annealing sareng léngkah ekstensi.

Léngkah denaturasi ngalibatkeun pemanasan kamar réaksi nepi ka 95 darajat Celsius sarta ngagunakeun éta pikeun denaturasi template DNA untaian ganda.

Dina lengkah saterusna, suhu réaksi diréduksi jadi 58 darajat Celsius, sahingga primer maju ka anneal kana bagian pelengkap template DNA untaian tunggal na.Suhu annealing langsung gumantung kana panjang sareng komposisi primer.

Dina léngkah ékspansi, DNA polimérase nyintésis untaian DNA anyar anu pelengkap kana untaian citakan DNA.Ku cara nambahkeun inti bébas pelengkap template dina 5′to 3′arah ti campuran réaksi.Suhu léngkah ieu gumantung kana DNA polimérase anu digunakeun.

Saatos siklus kahiji, target DNA untaian ganda dicandak.

Lajeng, asupkeun siklus kadua.DNA untai ganda didenaturasi pikeun ngahasilkeun dua molekul DNA untai tunggal.

Dina lengkah saterusna, suhu réaksi diturunkeun, primers dianil ka unggal témplat DNA untaian tunggal, jeung usik Taq-man diantelkeun kana bagian pelengkap DNA target.

Panyilidikan TaqMan diwangun ku hiji fluorophore sacara kovalén numbu ka tungtung 5′ usik oligonukleotida.Nalika bungah ku sumber cahaya tina cycler nu, fluorophore nu emits fluoresensi.Sajaba ti éta, usik diwangun ku hiji quencher di 3′tungtung.Deukeutna gén reporter ka quencher nyegah deteksi fluoresensi.

Dina hambalan extension, DNA polimérase nyintésis untaian anyar.Nalika polimérase ngahontal panyilidikan TaqMan, kagiatan 5′nuklease endogénna ngabeulah panyilidikan, misahkeun pewarna tina pamadam.

Kalayan unggal siklus PCR, langkung seueur molekul pewarna anu dileupaskeun, nyababkeun paningkatan inténsitas fluoresensi sabanding sareng jumlah amplikon anu disintésis.

Metoda ieu ngamungkinkeun keur estimasi jumlah runtuyan tinangtu hadir dina sampel.Jumlah fragmén DNA untaian ganda ganda dina unggal siklus.Ku alatan éta, PCR bisa dipaké pikeun nganalisis sampel pisan leutik.

Pikeun ngukur sinyal fluoresensi, lampu halogén tungsten, saringan éksitasi, pemantul, lénsa, saringan émisi sareng ngecas gandeng kaméra CCD nganggo alat.

Léngkah 4 Ngadeteksi

Pikeun ngukur sinyal fluoresensi, lampu halogén tungsten, saringan éksitasi, pemantul, lénsa, saringan émisi sareng ngecas gandeng kaméra CCD nganggo alat.

Cahaya anu disaring tina lampu dipantulkeun ku pemantul, ngalangkungan lénsa condenser, sareng dipuseurkeun ka tengah unggal liang.Lajeng fluoresensi dipancarkeun tina liang ieu reflected tina eunteung, ngaliwatan filter émisi, sarta ditandaan ku kaméra CCD.Dina unggal siklus PCR, lampu fluorophore timer gumbira bisa ditandaan ku CCD.

Éta ngarobih cahaya anu dicandak kana data digital.Metoda ieu disebut real-time PCR, sarta ngamungkinkeun real-time ngawaskeun kamajuan réaksi PCR.