Salaku anu anyar di laboratorium, sanés padamelan anu saé pikeun nyaring pepelakan positip tina sakumpulan pepelakan kalayan tingkat konversi anu rendah.Kahiji, DNA kudu sasari tina sajumlah badag sampel hiji-hiji, lajeng gén asing bakal dideteksi ku PCR.Sanajan kitu, hasilna mindeng blanks jeung band kalawan sababaraha item kalana, tapi mustahil pikeun nangtukeun naha aya deteksi lasut atawa deteksi palsu..Naha teu daya teu upaya pikeun nyanghareupan prosés sareng hasil ékspérimén sapertos kitu?Tong hariwang, lanceuk ngajarkeun anjeun kumaha carana nyaring pepelakan positip transgenik kalayan gampang sareng akurat.

Lengkah 1

Primer deteksi desain

Nangtukeun gén endogenous jeung gén exogenous nu bakal dideteksi nurutkeun sampel bakal diuji, tur pilih runtuyan 100-500bp wawakil dina gén keur desain primér.Primer alus bisa mastikeun akurasi hasil deteksi jeung shorten waktu deteksi (tingali lampiran pikeun primers deteksi ilahar dipaké).

Catetan: Primer anu nembé dirarancang kedah ngaoptimalkeun kaayaan réaksi sareng pariksa akurasi, presisi sareng wates deteksi deteksi sateuacan deteksi skala ageung.

Lengkah 2

Desain protokol ékspérimén

Kontrol positif: Paké DNA dimurnikeun ngandung fragmen target salaku citakan pikeun nangtukeun naha sistem réaksi PCR jeung kaayaan normal.

négatif / kontrol kosong: Paké template DNA atawa ddH2O nu teu ngandung fragmen target salaku citakan pikeun ngadeteksi naha aya sumber kontaminasi dina sistem PCR.

Kontrol rujukan internal: make kombinasi primer / usik tina gén endogenous sampel pikeun diuji pikeun evaluate naha citakan bisa dideteksi ku PCR.

bewara:

Positip, négatif/kosong kontrol jeung kontrol kontrol internal kudu diatur pikeun tiap tés pikeun evaluate validitas hasil eksperimen.

Persiapan ékspérimén

Sateuacan dianggo, perhatikeun naha solusina dicampur rata.Upami aya présipitasi, éta kedah leyur sareng dicampur dumasar kana petunjuk sateuacan dianggo.2×PCR campuran perlu pipetted jeung dicampur sababaraha kali jeung micropipette saméméh dipaké pikeun nyingkahan distribusi ion henteu rata.

bewara:

Candak kaluar manual tur baca eta taliti, sarta nyieun olahan saméméh percobaan luyu ketat jeung sarat tina manual.

Lengkah 4

Nyiapkeun sistem réaksi PCR

Numutkeun protokol eksperimen, campur primers, H2O, sarta 2×PCR campur merata, centrifuge jeung ngadistribusikaeun ka unggal tube réaksi.

bewara:

Pikeun uji skala ageung atanapi jangka panjang, disarankeun ngagunakeun sistem réaksi PCR anu ngandung énzim UNG, anu sacara efektif tiasa nyegah kontaminasi aerosol anu disababkeun ku produk PCR.

Lengkah 5

Tambahkeun template réaksi

Ngagunakeun téhnologi langsung PCR, aya teu kudu prosés purifikasi asam nukléat tedious, template sampel bisa disiapkeun dina 10 menit, sarta sistem réaksi PCR pakait bisa ditambahkeun.

bewara:

Métode cleavage gaduh pangaruh deteksi anu langkung saé, sareng produk anu dicandak tiasa dianggo pikeun sababaraha réaksi deteksi.

5.1: ékspansi langsung daun

Numutkeun ukuran gambar dina manual, potong jaringan daun kalayan diaméter 2-3mm sareng nempatkeun kana sistem réaksi PCR.

Catetan: Pastikeun yén fragmen daun sagemblengna immersed dina solusi réaksi PCR, sarta ulah nambahkeun jaringan daun kaleuleuwihan.

5.2: Métode pamisah daun

Potong jaringan daun kalayan diaméter 5-7mm sareng nempatkeun kana tabung centrifuge.Upami anjeun milih daun asak, punten ulah nganggo jaringan urat utama daun.Pipet 50ul panyangga P1 lysate kana tube centrifuge pikeun mastikeun yén lysate nu lengkep bisa neuleumkeun jaringan daun, nempatkeun eta dina cycler termal atawa mandi logam, sarta lyse dina 95 ° C pikeun 5-10 menit.

Tambahkeun 50ul Buffer P2 solusi nétralisasi jeung mix ogé.Lysate hasilna bisa dipaké salaku citakan sarta ditambahkeun kana sistem réaksi PCR.

Catetan: Jumlah template antara 5-10% tina sistem PCR, sarta teu kudu ngaleuwihan 20% (contona, dina sistem PCR 20μl, tambahkeun 1-2μl leyuran lysis, teu leuwih ti 4μl).

Lengkah 6

réaksi PCR

Saatos centrifuging tabung réaksi PCR, éta disimpen dina alat PCR pikeun amplifikasi.

bewara:

Réaksina ngagunakeun citakan anu henteu dimurnikeun pikeun amplifikasi, sahingga jumlah siklus amplifikasi 5-10 siklus langkung seueur tibatan nalika ngagunakeun citakan DNA anu dimurnikeun.

Lengkah 7

Deteksi éléktroforésis sareng analisa hasil

M: Tangga DNA 100bp

1\4: Métode DNA dimurnikeun

2\5: Métode PCR langsung

3\6: Kadali kosong

QC:

Hasil tés tina sababaraha kontrol anu disetél dina percobaan kedah nyumponan kaayaan di handap ieu.Upami teu kitu, anu nyababkeun masalah kedah dianalisis, sareng tés kedah dilakukeun deui saatos masalahna dileungitkeun.

Tabél 1. Hasil tés normal tina sababaraha kelompok kontrol

* Nalika plasmid dipaké salaku kontrol positif, hasil tés gén endogenous bisa négatip

Hasil kaputusan:

A. Hasil tés gén endogenous sampel négatip, nunjukkeun yén DNA cocog pikeun deteksi PCR biasa teu bisa sasari tina sampel atawa DNA sasari ngandung sambetan réaksi PCR, sarta DNA kudu sasari deui.

B. Hasil uji tina gén endogenous sampel positif, sarta hasil tés gén exogenous négatip, nunjukkeun yén DNA cocog pikeun deteksi PCR biasa sasari tina sampel, sarta eta bisa judged yén gén XXX teu kauninga dina sampel.

C. Hasil tés tina gén endogenous sampel positif, sarta hasil tés gén exogenous positif, nunjukkeun yén DNA cocog pikeun deteksi PCR biasa geus sasari tina sampel, sarta sampel DNA ngandung gén XXX.Ékspérimén konfirmasi tiasa dilaksanakeun salajengna.

Lengkah 8

Primer deteksi desain

Saatos percobaan, paké 2% larutan natrium hipoklorit sareng 70% larutan étanol pikeun ngusap daérah ékspérimén pikeun nyegah polusi lingkungan.