一, Ningkatkeun sensitipitas sistem réaksi:

1. Ngasingkeun kualitas luhur RNA:

Sintésis cDNA anu suksés asalna tina RNA kualitas luhur.RNA kualitas luhur sahenteuna kudu pinuh-panjang tur bébas tina inhibitor transcriptase sabalikna kayaning EDTA atawa SDS.Kualitas RNA nangtukeun jumlah maksimum informasi runtuyan anjeun bisa nranskripsikeun kana cDNA.Métode purifikasi RNA anu umum nyaéta metode salengkah ngagunakeun guanidine isothiocyanate / asam fénol.Pikeun nyegah kontaminasi ku jumlah renik RNase, RNA anu diisolasi tina conto anu beunghar RNase (sapertos pankréas) kedah disimpen dina formaldehida pikeun ngajaga RNA kualitas luhur, khususna pikeun neundeun jangka panjang.RNA anu diekstrak tina ati beurit dasarna didegradasi saatos disimpen dina cai salami saminggu, sedengkeun RNA anu diekstrak tina limpa beurit tetep stabil saatos disimpen dina cai salami 3 taun.Sajaba ti éta, transkrip leuwih panjang batan 4 kb leuwih sénsitip kana degradasi ku renik RNases ti transkrip leutik.Pikeun ngaronjatkeun stabilitas sampel RNA disimpen, RNA bisa leyur dina formamide deionized tur disimpen dina -70 ° C.Formamide anu dipaké pikeun ngawétkeun RNA kudu bébas tina lebu RNA-degrading.RNA tina pankréas tiasa disimpen dina formamide sahenteuna sahenteuna sataun.Nalika Nyiapkeun pikeun ngagunakeun RNA, anjeun tiasa nganggo metodeu di handap ieu pikeun endapanana RNA: tambahkeun NaCl kana 0,2M sareng 4 kali volume étanol, nempatkeun dina suhu kamar salami 3-5 menit, sareng centrifuge dina 10,000 × g salami 5 menit.

2. Anggo RNaseH-inactive (RNaseH-) reverse transcriptase:

Inhibitor RNase mindeng ditambahkeun kana réaksi transkripsi sabalikna pikeun ngaronjatkeun panjang sarta ngahasilkeun sintésis cDNA.Inhibitor RNase kudu ditambahkeun salila réaksi sintésis untaian kahiji ku ayana panyangga jeung agén pangréduksi (saperti DTT), sabab prosés saméméh sintésis cDNA ngadénaturasi inhibitor, ku kituna ngaleupaskeun RNase kabeungkeut nu bisa ngadégradasi RNA.Inhibitor protein RNase ngan ukur nyegah degradasi RNA ku RNase A, B, C, sareng henteu nyegah RNase dina kulit, janten ati-ati henteu ngenalkeun RNase tina ramo anjeun sanaos ngagunakeun inhibitor ieu.

Reverse transcriptase ngatalisan konversi RNA kana cDNA.Duanana M-MLV sareng AMV gaduh kagiatan RNaseH endogen salian kagiatan polimérase sorangan.Aktivitas RNaseH jeung aktivitas polimérase saling bersaing pikeun untaian hibrida anu dibentuk antara témplat RNA jeung untaian primer DNA atawa untaian ekstensi cDNA, sarta ngadégradasi untaian RNA dina RNA: kompleks DNA.Témplat RNA anu didegradasi ku kagiatan RNaseH henteu tiasa deui janten substrat anu mujarab pikeun sintésis cDNA, anu ngirangan ngahasilkeun sareng panjang sintésis cDNA.Ku alatan éta, éta bakal aya mangpaatna pikeun ngaleungitkeun atawa greatly ngurangan aktivitas RNaseH of reverse transcriptase.

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase sareng thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, tiasa nampi jumlah langkung seueur sareng cDNA panjangna langkung seueur tibatan MMLV sareng AMV.Sensitipitas RT-PCR bakal kapangaruhan ku jumlah sintésis cDNA.ThermoScript jauh leuwih sénsitip ti AMV.Ukuran produk RT-PCR dibatesan ku kamampuan reverse transcriptase pikeun nyintésis cDNA, khususna nalika kloning cDNA anu langkung ageung.Dibandingkeun sareng MMLV, SuperScripⅡ sacara signifikan ningkatkeun ngahasilkeun produk RT-PCR anu panjang.The RNaseH-reverse transcriptase ogé geus ngaronjat thermostability, jadi réaksi bisa dipigawé dina suhu luhur batan normal 37-42 ° C.Dina kaayaan sintésis anu disarankeun, paké primer oligo(dT) sareng 10 μCi [α-P]dCTP.Total ngahasilkeun untaian kahiji diitung ngagunakeun métode présipitasi TCA.cDNA full-length dianalisis ngagunakeun pita ukuran-diurutkeun excised sarta diitung dina gél agarose basa.

3. Naikkeun suhu inkubasi pikeun transkripsi sabalikna:

Suhu inkubasi anu langkung luhur ngabantosan muka struktur sekundér RNA, ningkatkeun ngahasilkeun réaksi.Kanggo sabagéan ageung témplat RNA, inkubasi RNA sareng primer dina 65 ° C tanpa panyangga atanapi uyah, dituturkeun ku pendinginan gancang dina és bakal ngaleungitkeun kalolobaan struktur sekundér sareng ngamungkinkeun primer ngabeungkeut.Sanajan kitu, sababaraha citakan masih mibanda struktur sekundér, sanajan sanggeus denaturasi panas.Amplifikasi tina citakan hese ieu tiasa dilakukeun nganggo ThermoScript Reverse Transcriptase sareng nempatkeun réaksi transkripsi sabalikna dina suhu anu langkung luhur pikeun ningkatkeun amplifikasi.Suhu inkubasi anu langkung luhur ogé tiasa ningkatkeun spésifisitas, khususna nalika primer khusus gen (GSP) dianggo pikeun sintésis cDNA (tingali Bab 3).Lamun maké GSP, pastikeun yén Tm tina primers sarua jeung hawa inkubasi ekspektasi.Entong nganggo oligo(dT) sareng primer acak di luhur 60°C.Primer acak merlukeun inkubasi dina 25 ° C salila 10 menit saméméh ngaronjatna nepi ka 60 ° C.Salian ngagunakeun suhu transkripsi sabalikna nu leuwih luhur, spésifisitas ogé bisa ditingkatkeun ku cara mindahkeun langsung campuran RNA/primer tina suhu denaturasi 65°C ka suhu inkubasi transkripsi sabalikna jeung nambahkeun campuran réaksi 2× nu geus dipanaskeun (sintésis cDNA hot-start).Pendekatan ieu ngabantosan nyegah pasangan basa antarmolekul anu lumangsung dina suhu anu langkung handap.The sababaraha switching suhu diperlukeun pikeun RT-PCR bisa disederhanakeun ku ngagunakeun cycler termal.

Polimérase termostabil Tth tindakan minangka polimérase DNA ku ayana Mg2+ jeung salaku polimérase RNA ku ayana Mn2+.Éta tiasa dijaga haneut dina suhu maksimal 65 ° C.Tapi, ayana Mn2+ salila PCR ngurangan kasatiaan, nu ngajadikeun Tth polymerase kurang cocog pikeun amplifikasi-precision tinggi, kayaning kloning cDNA.Sajaba ti éta, Tth boga efisiensi transkripsi sabalikna low, nu ngurangan sensitipitas, sarta, saprak transkripsi sabalikna sarta PCR bisa dipigawé ku énzim tunggal, réaksi kontrol tanpa transkripsi sabalikna teu bisa dipaké pikeun ngabandingkeun produk amplifikasi cDNA jeung contaminating DNA génomik.Produk amplifikasi dipisahkeun.

4. Aditif nu ngamajukeun transkripsi sabalikna:

Aditif kaasup gliserol jeung DMSO ditambahkeun kana réaksi sintésis strand kahiji, nu bisa ngurangan stabilitas asam nukléat ganda-strand jeung ngabongkar struktur sekundér RNA.Nepi ka 20% gliserol atawa 10% DMSO bisa ditambahkeun tanpa mangaruhan aktivitas SuperScript II atawa MMLV.AMV ogé bisa toléran nepi ka 20% gliserol tanpa leungitna aktivitas.Pikeun maksimalkeun sensitipitas RT-PCR dina réaksi transkripsi balik SuperScriptⅡ, 10% gliserol bisa ditambahkeun jeung diinkubasi dina 45°C.Lamun 1/10 tina produk réaksi transkripsi sabalikna ditambahkeun kana PCR, mangka konsentrasi gliserol dina réaksi amplifikasi nyaéta 0,4%, nu teu cukup pikeun ngahambat PCR.

5. Perawatan RNaseH:

Perawatan réaksi sintésis cDNA sareng RNaseH sateuacan PCR tiasa ningkatkeun sensitipitas.Kanggo sababaraha témplat, panginten yén RNA dina réaksi sintésis cDNA nyegah beungkeutan produk amplifikasi, dimana perlakuan RNaseH tiasa ningkatkeun sensitipitas.Sacara umum, perlakuan RNaseH diperlukeun nalika ngagedekeun témplat target cDNA full-length panjang, sapertos low-copy tuberous scherosis II.Pikeun template hésé ieu, perlakuan RNaseH ditingkatkeun sinyal dihasilkeun SuperScript II atanapi AMV-sintésis cDNA.Kanggo sabagéan ageung réaksi RT-PCR, perlakuan RNaseH opsional, sabab léngkah denaturasi PCR dina 95°C umumna ngahidrolisis RNA dina RNA: kompleks DNA.

6. Ngaronjatkeun Métode Deteksi RNA Leutik:

RT-PCR utamana nangtang lamun ngan jumlah leutik RNA sadia.Glikogén ditambahkeun salaku pamawa salila isolasi RNA mantuan pikeun ngaronjatkeun ngahasilkeun sampel leutik.Glikogén bébas RNase bisa ditambahkeun dina waktos anu sareng nambahkeun Trizol.Glikogén larut dina cai sareng tiasa disimpen dina fase cai sareng RNA pikeun ngabantosan présipitasi salajengna.Pikeun sampel kirang ti 50 mg jaringan atawa 106 sél kultur, konsentrasi dianjurkeun glikogén bébas RNase nyaéta 250 μg/ml.

Nambahkeun BSA acetylated kana réaksi transkripsi sabalikna maké SuperScript II bisa ningkatkeun sensitipitas, sarta pikeun jumlah leutik RNA, ngurangan jumlah SuperScript II jeung nambahkeun 40 unit RNaseOut nuclease inhibitor bisa ningkatkeun tingkat deteksi.Lamun glikogén dipaké dina prosés isolasi RNA, éta masih dianjurkeun pikeun nambahkeun BSA atawa RNase inhibitor nalika maké SuperScript II pikeun réaksi transkripsi sabalikna.

二, Ningkatkeun spésifisitas RT-PCR

1. Asintésis CND:

Sintésis cDNA strand munggaran tiasa diprakarsai nganggo tilu metode anu béda, spésifisitas relatifna mangaruhan jumlah sareng jinis cDNA anu disintésis.

Métode primer acak nya éta paling saeutik husus tina tilu métode.Primer anneal dina sababaraha situs sapanjang transkrip, ngahasilkeun cDNA pondok, parsial-panjangna.Metoda ieu remen dipake pikeun meunangkeun 5′ runtuyan tungtung jeung pikeun ménta cDNA ti RNA citakan jeung wewengkon struktur sekundér atawa jeung situs terminasi nu teu bisa replicated ku reverse transcriptase.Pikeun meunangkeun cDNA pangpanjangna, babandingan primer jeung RNA dina unggal sampel RNA perlu ditangtukeun sacara émpiris.Konsentrasi awal primer acak dibasajankeun 50 nepi ka 250 ng per 20 μl réaksi.Kusabab cDNA disintésis tina total RNA ngagunakeun primer acak utamana RNA ribosom, poli(A)+RNA umumna dipilih salaku citakan.

Primer oligo(dT) leuwih spésifik batan primer acak.Hybridizes ka poli(A) buntut kapanggih dina tungtung 3′ lolobana mRNA eukariot.Kusabab poli(A)+ RNA kira-kira 1% nepi ka 2% tina total RNA, jumlah jeung pajeulitna cDNA jauh leuwih saeutik dibandingkeun jeung primer acak.Kusabab spésifisitasna anu luhur, oligo(dT) umumna henteu ngabutuhkeun optimasi rasio RNA kana primer sareng pilihan poli(A)+.Disarankeun ngagunakeun 0.5μg oligo(dT) per sistem réaksi 20μl.oligo (dT) 12-18 cocog pikeun kalolobaan RT-PCR.Sistem ThermoScript RT-PCR nawiskeun oligo(dT)20 kusabab stabilitas termal anu langkung saé pikeun suhu inkubasi anu langkung luhur.

Primer husus gen (GSP) nyaéta primer anu paling spésifik pikeun léngkah transkripsi sabalikna.GSP mangrupa oligonukleotida antisense nu bisa ngahibridisasi husus kana runtuyan udagan RNA, teu saperti primer acak atawa oligo(dT), nu anneal kana sakabéh RNA.Aturan anu sami anu dianggo pikeun ngarancang primer PCR dilarapkeun kana desain GSP dina réaksi transkripsi sabalikna.GSP tiasa sekuen anu sami sareng primer amplifikasi anu anneal ka tungtung 3'-paling mRNA, atanapi GSP tiasa dirarancang pikeun ngenalkeun hilir primer amplifikasi sabalikna.Pikeun sababaraha subjék anu diamplifikasi, leuwih ti hiji primer antisense perlu dirancang pikeun suksés RT-PCR sabab struktur sekundér RNA target bisa nyegah primer mengikat.Disarankeun ngagunakeun 1 pmol antisense GSP dina 20 μl réaksi sintésis untaian kahiji.

2. Naikkeun suhu inkubasi pikeun transkripsi sabalikna:

Pikeun ngamangpaatkeun pinuh ku spésifisitas GSP, hiji transkripase sabalikna kalawan thermostability luhur kudu dipaké.Transkriptase sabalikna termostabil tiasa diinkubasi dina suhu anu langkung luhur pikeun ningkatkeun keketatan réaksi.Contona, upami GSP anneals dina 55 ° C, spésifisitas tina GSP moal dimangpaatkeun sapinuhna lamun AMV atawa M-MLV dipaké pikeun transkripsi sabalikna dina stringency low 37 ° C.Nanging, SuperScript II sareng ThermoScript tiasa diréaksikeun dina 50 ° C atanapi langkung luhur, anu bakal ngaleungitkeun produk non-spésifik anu dihasilkeun dina suhu anu langkung handap.Pikeun spésifisitas maksimum, campuran RNA/primer bisa dialihkeun langsung ti 65 ° C suhu denaturasi kana hawa inkubasi transkripsi sabalikna sarta ditambahkeun kana campuran 2 × réaksi pre-warmed (sintésis cDNA panas mimiti).Ieu mantuan nyegah pasangan basa antarmolekul dina suhu low.The sababaraha transisi hawa diperlukeun pikeun RT-PCR bisa disederhanakeun ku ngagunakeun cycler termal.

3. Ngurangan kontaminasi DNA génomik:

Kasulitan poténsial anu dipendakan sareng RT-PCR nyaéta kontaminasi DNA génomik dina RNA.Ngagunakeun métode isolasi RNA alus, kayaning Trizol Reagent, bakal ngurangan jumlah DNA génomik contaminating persiapan RNA.Pikeun ngahindarkeun produk anu diturunkeun tina DNA génomik, RNA tiasa dirawat ku DNase I kelas amplifikasi pikeun ngaleungitkeun DNA anu kontaminasi sateuacan transkripsi ngabalikeun.Pencernaan DNase I ditungtungan ku inkubasi sampel dina 2,0 mM EDTA salila 10 menit dina 65 ° C.EDTA bisa chelate ion magnésium, nyegah magnésium ion-gumantung hidrolisis RNA dina suhu luhur.

Pikeun misahkeun cDNA anu diamplifikasi tina kontaminasi produk amplifikasi DNA génomik, primers bisa dirarancang anu unggal anneal pikeun misahkeun exon.Produk PCR anu diturunkeun tina cDNA bakal langkung pondok tibatan anu diturunkeun tina DNA génomik anu kacemar.Sajaba ti éta, percobaan kontrol tanpa transkripsi sabalikna dipigawé dina unggal citakan RNA pikeun nangtukeun naha fragmén dibikeun ieu diturunkeun tina DNA génomik atawa cDNA.Produk PCR diala tanpa transkripsi sabalikna diturunkeun tina génom.