Ⅰ. Ningkatkeun sensitipitas sistem réaksi:

1. misahkeun RNA kualitas luhur:

Sintésis cDNA anu suksés asalna tina RNA kualitas luhur.RNA-kualitas luhur kedah mastikeun sahenteuna langkung panjang sareng henteu ngandung sambetan anu henteu ngandung énzim rékaman, sapertos EDTA atanapi SDS.Kualitas RNA nangtukeun nilai maksimum informasi runtuyan anjeun bisa nranskripsikeun kana cDNA.Métode purifikasi RNA umum nyaéta metode léngkah ngagunakeun isosianat / acidophenol.Pikeun nyegah polusi RNase, RNA dipisahkeun tina sampel anu beunghar ku RNase (sapertos pankréas) ngabutuhkeun neundeun formaldehida pikeun ngahemat RNA kualitas luhur, anu langkung saé pikeun neundeun jangka panjang.RNA nu sasari tina ati beurit dasarna didegradasi sanggeus hiji minggu neundeun dina cai, sedengkeun RNA sasari tina limpa beurit tetep stabil sanggeus tilu taun disimpen dina cai.Salaku tambahan, transkrip anu langkung ageung tibatan 4kb langkung sénsitip pikeun ngalacak degradasi RNase tibatan transkrip leutik.Pikeun ngaronjatkeun stabilitas sampel RNA gudang, RNA bisa leyur dina méthalmamine ion, sarta disimpen -70 °C.Thilide dipaké pikeun nyimpen RNA teu kudu ngandung rupa-rupa objék nu ngadegradasi RNA.RNA, anu diturunkeun tina pankréas, tiasa disimpen dina méthalmamine sahenteuna sahenteuna sataun.Nalika anjeun siap ngagunakeun RNA, anjeun tiasa nganggo metodeu di handap ieu pikeun endapan RNA: tambahkeun NaCl kana 0,2m sareng 4 kali volume étanol, nempatkeun suhu kamar salami 3-5 menit, sareng 10.000 × g centrifugal salami 5 menit.

2. Anggo reverse transcriptase tanpa aktivitas RNaseH (RNaseH-):

Inhibitor RNase mindeng ditambahkeun kana réaksi transkripsi sabalikna pikeun ngaronjatkeun panjang sarta ngahasilkeun sintésis cDNA.Inhibitor RNase ditambahkeun dina réaksi sintésis ranté munggaran ku ayana panyangga sareng agén pangréduksi sapertos DTT sabab prosés sintésis pra-cDNA ngadénaturasi inhibitor, ku kituna ngaleupaskeun RNases kabeungkeut anu ngadégradasi RNA.Inhibitor Protéin RNase ngan ukur nyegah degradasi RNA ku RNase A, B, C, sareng henteu nyegah RNases dina kulit, janten ati-ati kedah dilakukeun henteu ngenalkeun RNases tina ramo sanajan nganggo inhibitor ieu.

Reverse transcriptase ngatalisan konvérsi RNA jadi cDNA.Duanana M-MLV sareng AMV gaduh kagiatan RNaseH endogen salian kagiatan polimérase sorangan.Aktivitas RNaseH bersaing jeung aktivitas polimérase pikeun untaian hétérozigot anu dibentuk antara témplat RNA jeung primer DNA atawa untaian ekstensi cDNA, sarta ngadégradasi RNA: untaian RNA dina kompléx DNA.Témplat RNA anu didegradasi ku kagiatan RNaseH henteu tiasa dianggo deui salaku substrat anu épéktip pikeun sintésis cDNA, ngirangan ngahasilkeun sareng panjang sintésis cDNA.Janten ngaleungitkeun atanapi ngirangan pisan kagiatan RNaseH tina transkripase ngabalikkeun bakal mangpaat pisan.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase of RNaseH- sareng thermoScript reverse transcriptase, AMV of RNaseH- ngahasilkeun cDNA full-length langkung seueur tibatan MMLV sareng AMV.Sensitipitas RT-PCR kapangaruhan ku jumlah cDNA anu disintésis.ThermoScript jauh leuwih sénsitip ti AMV.Ukuran produk RT-PCR dibatesan ku kamampuan reverse transcriptase pikeun nyintésis cDNA, khususna nalika kloning Cdna anu langkung ageung.Dibandingkeun sareng MMLV, SuperScripⅡ sacara signifikan ningkatkeun ngahasilkeun produk RT-PCR anu panjang.Transkripase balik RNaseH- ogé ningkatkeun stabilitas termal, ku kituna réaksina tiasa dilaksanakeun dina suhu anu langkung luhur tibatan normal 37-42 ℃.Dina kaayaan sintésis anu disarankeun, primer oligo(dT) sareng 10μCi [alfa-p]dCTP dianggo.Total produksi ranté munggaran diitung ngagunakeun métode présipitasi TCA.CDNA full-length dianalisis ngagunakeun panyabutan strip ukuran-diurutkeun jeung cacah dina gél agarose basa.

3. Ningkatkeun suhu pelestarian panas tina transkripsi sabalikna:

Suhu nahan anu langkung luhur ngabantosan muka struktur sekundér RNA sareng ningkatkeun ngahasilkeun réaksi.Kanggo sabagéan ageung témplat RNA, nahan RNA sareng primer dina suhu 65 ° C tanpa panyangga atanapi uyah teras niiskeun gancang dina és ngaleungitkeun kalolobaan struktur sekundér sareng ngamungkinkeun primer pikeun ngabeungkeut.Sanajan kitu, sababaraha citakan masih mibanda struktur sekundér, sanajan sanggeus denaturasi termal.Amplifikasi citakan hese ieu tiasa dilakukeun nganggo ThermoScript reverse transcriptase sareng ku cara nempatkeun réaksi reverse transcriptase dina suhu anu langkung luhur pikeun ningkatkeun amplifikasi.Suhu nahan anu langkung luhur ogé tiasa ningkatkeun spésifisitas, khususna nalika sintésis cDNA dilakukeun nganggo primer khusus gén (GSPS) (tingali Bab 3).Lamun maké GSP, pastikeun yén nilai Tm tina primer sarua jeung hawa nyekel ekspektasi.Ulah make oligo(dT) jeung primers acak luhur 60 ℃.Primes acak kudu dilaksanakeun dina 25 ℃ salila 10 menit saméméh ngaronjatna ka 60 ℃.Salian ngagunakeun suhu transkripsi sabalikna nu leuwih luhur, spésifisitas bisa ditingkatkeun ku cara mindahkeun langsung campuran RNA/primer tina suhu denaturing 65 ℃ ka suhu tahan transkripsi sabalikna jeung nambahkeun campuran réaksi 2× preheated (sintésis inisiasi termal cDNA).Pendekatan ieu ngabantosan nyegah pasangan basa antarmolekul anu lumangsung dina suhu anu langkung handap.Ngagunakeun alat PCR nyederhanakeun loba saklar suhu diperlukeun pikeun RT-PCR.

Tth panas stabilized polimérase meta salaku DNA polimérase ku ayana Mg2+ jeung RNA polimérase ku ayana Mn2+.Bisa nahan panas nepi ka 65 ℃.Tapi, ayana Mn2+ salila PCR ngurangan kasatiaan, nu ngajadikeun Tth polymerase kurang cocog pikeun amplifikasi precision tinggi, kayaning kloning cDNA.Sajaba ti éta, Tth kurang éfisién dina transkripsi sabalikna, nu ngurangan sensitipitas, sarta saprak hiji énzim tunggal bisa ngalakukeun transkripsi sabalikna sarta PCR, réaksi kontrol tanpa transkripsi sabalikna teu bisa dipaké pikeun ngabedakeun produk amplified cDNA ti DNA génomik kacemar.

4. Aditif anu ngamajukeun transkripsi sabalikna:

Penambahan aditif, kalebet gliserin sareng DMSO, kana réaksi sintésis ranté munggaran tiasa ngirangan stabilitas untaian ganda asam nukléat sareng ngaleungitkeun struktur sekundér RNA.Nepi ka 20% gliserin atawa 10% DMSO bisa ditambahkeun tanpa mangaruhan aktivitas SuperScriptⅡ atawa MMLV.AMV ogé bisa toléran nepi ka 20% gliserol tanpa ngurangan aktivitas.Pikeun maksimalkeun sensitipitas RT-PCR dina réaksi transkripsi balik SuperScriptⅡ, 10% gliserol tiasa ditambah sareng diisolasi dina suhu 45 ℃.Upami 1/10 produk rétrotranskripsi-réaksi ditambahkeun kana PCR, konsentrasi gliserol dina réaksi amplifikasi nyaéta 0,4%, anu henteu cekap pikeun ngahambat PCR.

5. Ngolah RNaseH:

Sensitipitas tiasa ningkat ku ngarawat réaksi sintésis cDNA sareng RNaseH sateuacan PCR.Kanggo sababaraha témplat, panginten yén RNA dina réaksi sintésis cDNA nyegah beungkeutan produk anu diamplifikasi, ku kituna perlakuan RNaseH tiasa ningkatkeun sensitipitas.Sacara umum, perlakuan RNaseH diperlukeun pikeun amplifikasi template target cDNA full-length kawilang panjang, kayaning tuberous scherosisⅡ kalawan salinan low.Pikeun citakan sesah ieu, RNaseH ningkatkeun sinyal anu dihasilkeun ku cDNA anu disintésis ku SuperScriptⅡ atanapi AMV.Kanggo sabagéan ageung réaksi RT-PCR, perlakuan RNaseH opsional sabab léngkah denaturasi PCR insulasi 95 ℃ biasana ngahidrolisis RNA tina RNA: kompléx DNA.

6. Métode ningkat pikeun ngadeteksi jumlah leutik RNA:

RT-PCR utamana nangtang lamun ngan jumlah leutik RNA sadia.Penambahan glikogén salaku pamawa salila pamisahan RNA mantuan pikeun ngaronjatkeun ngahasilkeun sampel leutik.Glikogén bébas RNase bisa ditambahkeun dina waktos anu sareng Trizol.Glikogén larut dina cai sareng tiasa tetep dina fase cai sareng RNA pikeun ngabantosan présipitasi salajengna.Konsentrasi glikogén bébas RNase anu disarankeun nyaéta 250μg/ml pikeun sampel kirang ti 50mg jaringan atanapi 106 sél berbudaya.

Penambahan BSA acetylated pikeun ngabalikeun réaksi transkripsi maké SuperScriptⅡ bisa ngaronjatkeun sensitipitas, sarta pikeun jumlah leutik RNA, ngurangan jumlah SuperScriptⅡ jeung nambahkeun 40 unit RnaseOut nuclease inhibitor bisa ngaronjatkeun tingkat deteksi.Upami glikogén dianggo dina pamisahan RNA, tambihan sambetan BSA atanapi RNase pikeun ngabalikeun réaksi transkripsi nganggo SuperScriptⅡ masih disarankeun.

Ⅱ. Ningkatkeun spésifisitas RT-PCR

1. sintésis cNDA:

Tilu padika anu béda tiasa dianggo pikeun ngamimitian sintésis cDNA untaian munggaran, sareng spésifisitas relatif unggal metode mangaruhan jumlah sareng jinis cDNA anu disintésis.

Métode primer acak nyaéta paling saeutik spésifik tina tilu métode.Primer dianil dina sababaraha situs sapanjang transkrip pikeun ngahasilkeun cDNA pondok, panjang parsial.Metoda ieu mindeng dipaké pikeun meunangkeun runtuyan terminal 5′ jeung cDNA tina citakan RNA jeung wewengkon struktural sekundér atawa jeung situs terminating nu transcriptase sabalikna teu bisa ngayakeun réplikasi.Pikeun meunangkeun cDNA pangpanjangna, babandingan primer jeung RNA dina unggal sampel RNA perlu ditangtukeun sacara émpiris.Konsentrasi awal primers acak dibasajankeun 50 nepi ka 250ng per 20μl sistem réaksi.Kusabab cDNA disintésis tina total RNA maké primers acak utamana RNA ribosom, poli(A)+RNA umumna dipilih salaku citakan.

Inisiasi Oligo(dT) langkung spésifik tibatan primer acak.Ieu hibridisasi jeung poli(A) buntut kapanggih dina tungtung 3′ mRNA dina lolobana sél eukariot.Kusabab poli(A)+RNA kira-kira 1% nepi ka 2% tina total RNA, jumlah jeung pajeulitna cDNA jauh leuwih saeutik ti lamun dipaké primers acak.Kusabab spésifisitasna anu luhur, oligo(dT) umumna henteu ngabutuhkeun optimasi pikeun rasio RNA kana primer sareng pilihan poli(A)+.Disarankeun ngagunakeun 0.5μg oligo(dT) per sistem réaksi 20μl.oligo (dT) 12-18 cocog pikeun kalolobaan RT-PCR.ThermoScript RT-PCR System nyadiakeun oligo(dT)20 kusabab stabilitas termal alus sarta cocog pikeun suhu nyekel luhur.

Primer spésifik gen (GSP) nyaéta primer spésifik pangalusna pikeun léngkah transkripsi sabalikna.GSP mangrupa antisense oligonucleoside nu husus bisa hibridisasi jeung runtuyan tujuan RNA, tinimbang anneal sakabéh Rnas kawas primers acak atawa oligo(dT).Aturan anu digunakeun pikeun ngararancang primer PCR ogé dilarapkeun kana desain réaksi transkripsi balik GSP.GSP tiasa sekuen anu sami sareng primer amplifikasi anu dianil dina tungtung mRNA3′, atanapi GSP tiasa dirarancang pikeun dianil di hilir nganggo primer amplifikasi sabalikna.Pikeun sababaraha obyék anu diamplifikasi, perlu ngadesain leuwih ti hiji primer antisense pikeun RT-PCR suksés sabab struktur sekundér RNA udagan bisa nyegah primer tina ngariung.Disarankeun ngagunakeun 1pmol antisense GSP dina sistem réaksi sintésis ranté munggaran 20μl.

2. Ningkatkeun suhu pelestarian panas tina transkripsi sabalikna:

Dina raraga ngamangpaatkeun pinuh spésifisitas GSP, reverse transcriptase kalawan stabilitas termal tinggi kudu dipake.Transkriptase balik anu stabil-panas tiasa diisolasi dina suhu anu langkung luhur pikeun ningkatkeun rigor réaksi.Contona, upami hiji GSP dianil dina 55 ° C, spésifisitas GSP teu dimangpaatkeun sapinuhna lamun transkripsi sabalikna dipigawé dina 37 ° C kalawan rigor low maké AMV atawa M-MLV.Tapi, SuperScripⅡ sareng ThermoScript tiasa ngaréaksikeun dina 50 ℃ atanapi langkung luhur, anu ngaleungitkeun produk nonspésifik anu diproduksi dina suhu anu langkung handap.Pikeun spésifisitas maksimum, campuran RNA/primer bisa dialihkeun langsung tina suhu denaturasi 65 ℃ ka suhu tahan transkripsi sabalikna kalawan tambahan campuran 2 x réaksi preheated (inisiasi termal sintésis cDNA).Ieu mantuan nyegah papasangan basa antara molekul dina suhu low.Ngagunakeun alat PCR simplifies loba transisi suhu diperlukeun pikeun RT-PCR.

3. Ngurangan kontaminasi DNA génomik:

Hiji poténsi kasusah jeung RT-PCR nyaéta yén RNA ngotorkeun DNA génomik.Pamakéan metode pamisahan RNA anu langkung saé, sapertos Trizol Reagent, ngirangan kontaminasi DNA génomik dina persiapan RNA.Pikeun ngahindarkeun produk anu dihasilkeun tina DNA génomik, RNA tiasa dirawat ku DnasⅠ kelas amplifikasi pikeun ngaleungitkeun DNA anu kacemar sateuacan transkripsi ngabalikeun.Sampel disimpen dina 65 ℃ dina 2.0mM EDTA salami 10 mnt pikeun ngeureunkeun nyerna DNaseⅠ.EDTA kelat ion magnésium pikeun nyegah hidrolisis RNA gumantung ion magnésium anu lumangsung dina suhu luhur.

Pikeun misahkeun cDNA diamplifikasi tina produk amplifikasi DNA génom, primers anu anneal misah jeung exon dipisahkeun bisa dirancang.Produk PCR anu diturunkeun tina cDNA bakal langkung pondok tibatan anu diturunkeun tina DNA génomik anu kacemar.Percobaan dikawasa tanpa transkripsi sabalikna ogé dipigawé dina unggal citakan RNA pikeun nangtukeun naha sempalan tinangtu tina DNA génomik atawa cDNA.Produk PCR diala dina henteuna transkripsi sabalikna diturunkeun tina génom.

Produk patali

RT-PCR Gampang^ᵀᴹI (Satu Lengkah)

- Kit hiji-léngkah ngamungkinkeun transkripsi ngabalikeun sareng PCR dilaksanakeun dina tabung anu sami.Éta ngan ukur kedah nambihan RNA template, primer PCR khusus sareng ddH Bebas RNase₂O.

-Analisis kuantitatif RNA sacara real-time tiasa dilaksanakeun gancang sareng akurat.

- Kit ngagunakeun réagen transkripsi sabalikna Foregene unik sareng Foregene HotStar Taq DNA Polymerase digabungkeun sareng sistem réaksi anu unik pikeun sacara efektif ningkatkeun efisiensi amplifikasi sareng spésifisitas réaksina.

Sistim réaksi dioptimalkeun -The ngajadikeun réaksi boga sensitipitas deteksi luhur, stabilitas termal kuat, sarta kasabaran hadé.

RT Easy II (Kalayan GDNase) Master Premix Pikeun Sintésis CDNA First-Strand Pikeun Real Time PCR Sareng GDNase

-Kamampuhan efisien ngaleupaskeun gDNA, nu bisa nyabut gDNA dina citakan dina 2 menit.

-Sistem transkripsi sabalikna anu efisien, ngan ukur peryogi 15 menit pikeun ngarengsekeun sintésis cDNA untaian munggaran.

-Templat kompléks: témplat kalawan eusi GC tinggi jeung struktur sekundér kompléks ogé bisa dibalikkeun kalawan efisiensi tinggi.

-Sistem transkripsi sabalikna sensitipitas luhur, témplat tingkat pg ogé tiasa nampi cDNA kualitas luhur.

-Sistem transkripsi sabalikna gaduh stabilitas termal anu luhur, suhu réaksi anu optimal nyaéta 42 ℃, sareng éta masih gaduh kinerja transkripsi sabalikna anu saé dina 50 ℃.