1. Pengetahuan dasar (upami hoyong ningali bagian ékspérimén, mangga transfer langsung ka bagian kadua)
Salaku réaksi turunan PCR konvensional, nyata waktu PCR utamana ngawas parobahan jumlah produk Gedekeun dina unggal siklus réaksi Gedekeun PCR sacara real waktu ngaliwatan parobahan sinyal fluoresensi, sarta quantitatively nganalisa template dimimitian ngaliwatan hubungan antara nilai ct jeung kurva baku.
Data husus tina RT-PCR nyaétadasarna, bangbarung fluoresensijeungnilai Ct.
| dasar: | Nilai fluoresensi tina siklus ka-3-15 nyaéta garis dasar (baseline), anu disababkeun ku kasalahan kadang-kadang tina pangukuran. |
| Ambang (threshold): | Ngarujuk kana wates deteksi fluoresensi anu disetél dina posisi anu pas dina daérah pertumbuhan éksponénsial tina kurva amplifikasi, umumna 10 kali simpangan baku tina garis dasar. |
| Nilai CT: | Ieu mangrupikeun jumlah siklus PCR nalika nilai fluoresensi dina unggal tabung réaksi ngahontal ambang. Nilai Ct berbanding terbalik sareng jumlah template awal. |
Métode labél umum pikeun RT-PCR:
| métode | Kauntungannana | kakurangan | wengkuan aplikasi |
| SYBR HéjoⅠ | Applicability lega, sénsitip, mirah tur merenah | syarat Primer anu luhur, rawan pita non-spésifik | Ieu cocog pikeun analisis kuantitatif rupa gén target, panalungtikan ngeunaan éksprési gén, sarta panalungtikan ngeunaan sato rekombinan transgenik jeung tutuwuhan. |
| TaqMan | spésifisitas alus tur repeatability tinggi | Hargana luhur sareng ngan cocog pikeun tujuan khusus. | Deteksi patogén, panalungtikan gén résistansi ubar, penilaian efficacy ubar, diagnosis panyakit genetik. |
| lantera molekular | spésifisitas tinggi, fluoresensi, latar low | Hargana luhur, ngan ukur cocog pikeun tujuan anu khusus, desainna sesah, sareng hargana luhur. | Analisis gén spésifik, analisis SNP |
2. Léngkah ékspérimén
2.1 Ngeunaan kelompok ékspérimén- kedah aya sababaraha sumur dina grup, sareng kedah aya pengulangan biologis.
| ① | Kadali kosong | Dipaké pikeun ngadeteksi status pertumbuhan sél dina percobaan |
| ② | SiRNA kontrol négatip (urutan siRNA non-spésifik) | Mendemonstrasikan spésifisitas aksi RNAi.siRNA tiasa nyababkeun réspon setrés non-spésifik dina konsentrasi 200nM. |
| ③ | Transfection réagen Control | Ngaleungitkeun karacunan réagen transfeksi kana sél atanapi pangaruh kana ekspresi gen target |
| ④ | siRNA ngalawan gén target | Sambel turun ekspresi gén target |
| ⑤ (opsional) | siRNA positif | Dipaké pikeun troubleshoot sistem ékspérimén jeung masalah operasional |
| ⑥ (opsional) | kontrol fluoresensi siRNA | Éféktivitas transfeksi sél bisa dititénan ku mikroskop |
2.2 Prinsip desain primér
| Ukuran fragmen amplified | Preferably dina 100-150bp |
| Panjang Primer | 18-25 bp |
| eusi GC | 30% -70%, langkung saé 45% -55% |
| Nilai tm | 58-60 ℃ |
| Runtuyan | Hindarkeun T / C kontinyu;A/G kontinyu |
| 3 runtuyan tungtung | Hindarkeun GC beunghar atanapi AT beunghar;base terminal preferably G atawa C;Hadé pisan pikeun nyingkahan T |
| Komplementaritas | Hindarkeun runtuyan pelengkap leuwih ti 3 basa dina primer atawa antara dua primers |
| Spésifikasi | Paké pilarian blast pikeun mastikeun spésifisitas primer |
①SiRNA spésifik-spésifik, sarta runtuyan spésiés béda bakal béda.
②SiRNA dibungkus dina bubuk beku-garing, anu tiasa disimpen sacara stabil salami 2-4 minggu dina suhu kamar.
2.3 Parabot atawa réagen nu kudu disiapkeun samemehna
| Primer (rujukan internal) | Kaasup maju jeung mundur dua |
| Primer (gen target) | Kaasup maju jeung mundur dua |
| Target Si RNA (3 strip) | Sacara umum, pausahaan bakal nyintésis 3 strips, lajeng milih salah sahiji tilu ku RT-PCR |
| Kit Transfeksi | Lipo2000 jsb. |
| Kit Ekstraksi Rapid RNA | Pikeun ékstraksi RNA sanggeus transfection |
| Rapid Reverse Transkripsi Kit | pikeun sintésis cDNA |
| Kit Amplifikasi PCR | 2×Super SYBR Héjo qPCR Master Campur |
2.4 Ngeunaan hal-hal anu kudu diperhatikeun dina léngkah-léngkah ékspérimén husus:
①siRNA prosés transféksi
1. Pikeun plating, Anjeun bisa milih plat 24-sumur, plat 12-sumur atawa plat 6-sumur (konsentrasi RNA rata-rata diusulkeun dina unggal sumur tina plat 24-sumur kira 100-300 ng/uL), sarta kapadetan transfection optimal sél nepi ka 60% -80% atawa leuwih.
2. Léngkah transfection sarta sarat husus anu mastikeun luyu jeung parentah.
3. Saatos transfection, sampel bisa dikumpulkeun dina 24-72 jam pikeun deteksi mRNA (RT-PCR) atawa deteksi protéin dina 48-96 jam (WB)
② prosés ékstraksi RNA
1. Nyegah kontaminasi ku énzim exogenous.Utamana kalebet ngagem topéng sareng sarung tangan sacara ketat;ngagunakeun tip pipette sterilized jeung tabung EP;cai nu dipaké dina percobaan kudu RNase-Free.
2. Disarankeun ngalakukeun dua kali sakumaha ngusulkeun dina kit ékstraksi gancang, nu bener bakal ngaronjatkeun purity sarta ngahasilkeun.
3. Cairan runtah teu kedah keuna kana kolom RNA.
③ kuantifikasi RNA
Saatos RNA diekstrak, éta tiasa diukur langsung sareng Nanodrop, sareng bacaan minimum tiasa dugi ka 10ng/ul.
④Prosés transkripsi sabalikna
1. Kusabab sensitipitas luhur RT-qPCR, sahenteuna 3 sumur paralel kudu dilakukeun pikeun tiap sampel pikeun nyegah Ct saterusna jadi béda teuing atawa SD jadi badag teuing pikeun analisis statistik.
2. Ulah freeze jeung ngalembereh Master campuran sababaraha kali.
3. Unggal tabung / liang kudu diganti ku tip anyar!Ulah terus-terusan ngagunakeun tip pipette sarua pikeun nambahkeun sampel!
4. Film napel na piring 96-sumur sanggeus nambahkeun sampel perlu smoothed kalawan piring a.Hadé pisan mun éta centrifuge saméméh nempatkeun eta dina mesin, ku kituna cairan dina témbok tube bisa ngalir ka handap tur miceun gelembung hawa.
⑤Analisis kurva umum
| Taya periode tumuwuhna logaritmik | Kamungkinan konsentrasi citakan anu luhur |
| Taya nilai CT | Léngkah-léngkah anu salah pikeun ngadeteksi sinyal fluoresensi; degradasi primers atanapi panyilidikan - integritas na bisa ditandaan ku PAGE éléktroforésis; jumlah template teu cukup; degradasi témplat - Ngahindarkeun bubuka najis sarta terus-terusan katirisan sarta thawing dina persiapan sampel; |
| Ct>38 | efisiensi amplifikasi low;produk PCR panjang teuing;rupa-rupa komponén réaksi didegradasi |
| Kurva amplifikasi linier | Panyilidikan bisa jadi sawaréh didegradasi ku siklus freeze-thaw diulang atawa paparan berkepanjangan ka cahaya |
| Beda dina duplikat liang utamana badag | Leyuran réaksi teu sagemblengna dilebur atawa solusi réaksi teu dicampur;mandi termal tina alat PCR kacemar ku zat fluoresensi |
2.5 Ngeunaan analisis data
Analisis data qPCR bisa dibagi kana kuantifikasi relatif jeung kuantifikasi mutlak.Contona, sél dina grup perlakuan dibandingkeun jeung sél dina grup kontrol,
Sabaraha kali mRNA tina gén X robah, ieu téh kuantifikasi relatif;dina sababaraha sél, mRNA tina gén X
Sabaraha salinan aya, ieu kuantitas mutlak.Biasana anu paling sering dianggo di laboratorium nyaéta metode kuantitatif relatif.Biasana,métode 2-ΔΔctpaling sering dianggo dina percobaan, janten ngan ukur metode ieu anu bakal diwanohkeun sacara rinci di dieu.
Métode 2-ΔΔct: Hasil anu dimeunangkeun nyaéta bédana éksprési gén udagan dina kelompok ékspérimén relatif ka gén udagan dina kelompok kontrol.Diperlukeun yén efisiensi amplifikasi duanana gén target sareng gén rujukan internal caket kana 100%, sareng simpangan relatif henteu kedah langkung ti 5%.
Métode itungan nyaéta kieu:
Δct grup kontrol = nilai ct gén sasaran dina grup kontrol - nilai ct gén rujukan internal dina grup kontrol
Δct grup ékspérimén = nilai ct tina gén sasaran dina grup ékspérimén - nilai ct tina gén rujukan internal dina grup ékspérimén
ΔΔct = Δct grup ékspérimén-Δct grup kontrol
Tungtungna, ngitung sababaraha bédana dina tingkat ekspresi:
Robah Fold = 2-ΔΔct (cocog sareng fungsi excel nyaéta POWER)
Produk patali:
waktos pos: Méi-20-2023
