• PCR nyaéta métode anu digunakeun pikeun ngagedékeun DNA tina sajumlah leutik citakan DNA.RT-PCR ngagunakeun transkripsi sabalikna pikeun ngahasilkeun template DNA tina sumber RNA nu lajeng bisa diamplified.
• PCR jeung RT-PCR ilaharna mangrupa réaksi endpoint, sedengkeun qPCR jeung RT-qPCR ngagunakeun kinétika laju sintésis produk salila réaksi PCR pikeun ngitung jumlah template hadir.
• Métode anu langkung énggal, sapertos PCR digital, nyayogikeun kuantitas mutlak tina citakan DNA awal, sedengkeun metode sapertos PCR isothermal ngirangan kabutuhan alat anu mahal pikeun masihan hasil anu dipercaya.

Réaksi ranté polimérase (PCR) nyaéta téknik biologi molekular anu kawilang basajan tur loba dipaké pikeun ngagedékeun jeung ngadeteksi runtuyan DNA jeung RNA.Dibandingkeun sareng metode tradisional kloning sareng amplifikasi DNA, anu sering tiasa nyandak sababaraha dinten, PCR ngan ukur peryogi sababaraha jam.PCR sensitip pisan sareng ngabutuhkeun template minimal pikeun deteksi sareng amplifikasi sekuen khusus.Métode PCR dasar parantos langkung maju tina deteksi DNA sareng RNA sederhana.Di handap ieu, kami parantos nyayogikeun tinjauan ngeunaan metode PCR anu béda sareng réagen anu kami nyayogikeun di Enzo Life Sciences pikeun kaperluan panalungtikan anjeun.Kami tujuanana pikeun ngabantosan para ilmuwan gancang ngaksés réagen PCR pikeun dianggo dina proyék panalungtikan salajengna!

PCR

Pikeun PCR standar, anu anjeun peryogikeun nyaéta polimérase DNA, magnesium, nukléotida, primer, template DNA anu bakal diamplifikasi, sareng thermocycler.Mékanisme PCR téh basajan sakumaha tujuanana: 1) DNA untai ganda (dsDNA) didenaturasi panas, 2) primer align jeung untaian DNA tunggal, jeung 3) primers diperpanjang ku DNA polymerase, hasilna dua salinan tina. untaian DNA asli.Prosés denaturasi, annealing, sarta elongation ngaliwatan runtuyan hawa sarta kali katelah hiji siklus amplifikasi (Gbr. 1).

Unggal hambalan tina siklus kudu dioptimalkeun pikeun citakan jeung set primer dipaké.Siklus ieu diulang kirang langkung 20-40 kali, sareng produk anu diamplifikasi teras tiasa dianalisis, biasana ku gél agarose (Gbr. 2).

Kusabab PCR mangrupikeun metode anu sénsitip pisan sareng volume anu alit pisan diperyogikeun pikeun réaksi tunggal, persiapan campuran master pikeun sababaraha réaksi disarankeun.Campuran induk kedah dicampur saé teras dibeulah ku jumlah réaksi, mastikeun yén unggal réaksi ngandung jumlah énzim, dNTP, sareng primer anu sami.Seueur panyadia, sapertos Enzo Life Sciences, nawiskeun ogé campuran PCR anu parantos ngandung sadayana kecuali primer sareng template DNA.

Wewengkon anu beunghar Guanin/Cytosine (beunghar GC) ngagambarkeun tantangan dina téknik PCR standar.Sekuen anu beunghar GC langkung stabil tibatan sekuen anu eusi GC langkung handap.Saterusna, runtuyan-euyeub GC condong ngabentuk struktur sekundér, kayaning puteran hairpin.Hasilna, untaian ganda anu beunghar GC hese dipisahkeun sacara lengkep nalika fase denaturasi.Akibatna, DNA polimérase teu bisa nyintésis untaian anyar tanpa halangan.Suhu denaturasi anu langkung luhur tiasa ningkatkeun ieu, sareng panyesuaian ka arah suhu annealing anu langkung luhur sareng waktos annealing anu langkung pondok tiasa nyegah beungkeutan anu henteu spésifik tina primer anu beunghar GC.Réagen tambahan bisa ningkatkeun amplifikasi runtuyan-euyeub GC.DMSO, gliserol, sareng betaine ngabantosan ngaganggu struktur sekundér anu disababkeun ku interaksi GC sareng ku kituna ngagampangkeun pamisahan untaian ganda.

Panas Mimitian PCR

Amplifikasi teu spésifik mangrupikeun masalah anu tiasa lumangsung nalika PCR.Kaseueuran polimérase DNA anu dianggo pikeun PCR tiasa dianggo pangsaéna dina suhu sakitar 68°C dugi ka 72°C.Énzim ogé tiasa aktip dina suhu anu langkung handap, sanaos tingkat anu langkung handap.Dina suhu jauh di handap suhu annealing, primers bisa ngabeungkeut non-spésifik tur ngakibatkeun amplifikasi non-spésifik, sanajan réaksina diatur dina és.Ieu bisa dicegah ku ngagunakeun sambetan polimérase anu misahkeun tina polimérase DNA ngan sakali suhu nu tangtu geus ngahontal, ku kituna istilah panas mimiti PCR.Inhibitor tiasa janten antibodi anu ngabeungkeut polimérase sareng denaturasi dina suhu denaturasi awal (biasana 95 ° C).

Polimérase Kasatiaan Tinggi

Bari polimérase DNA ngagedékeun cukup akurat kana runtuyan citakan aslina, kasalahan dina cocog nukléotida bisa lumangsung.Teu cocog dina aplikasi sapertos kloning tiasa nyababkeun transkrip dipotong, sareng salah tarjamahan atanapi protéin teu aktif di hilir.Pikeun ngahindarkeun mismatches ieu, polimérase sareng kagiatan "proofreading" parantos diidentifikasi sareng dilebetkeun kana alur kerja.Polimérase proofreading munggaran, Pfu, diidentifikasi dina taun 1991 di Pyrococcus furiosus.Énzim Pfu ieu miboga aktivitas exonuclease 3' nepi ka 5'.Nalika DNA diamplifikasi, exonuclease ngaleungitkeun nukléotida anu teu cocog dina tungtung 3' untaian.Nukléotida nu bener tuluy diganti, jeung sintésis DNA terus.Idéntifikasi runtuyan nukléotida anu salah dumasar kana afinitas beungkeutan pikeun nukléosida trifosfat anu bener jeung énzim, dimana beungkeutan anu teu éfisién ngalambatkeun sintésis sarta ngamungkinkeun pikeun ngagantian anu bener.Kagiatan proofreading Pfu polimérase ngahasilkeun kasalahan pangsaeutikna dina runtuyan ahir dibandingkeun Taq DNA polimérase.Dina taun-taun ayeuna, énzim proofreading sanés parantos dikenalkeun, sareng modifikasi énzim Pfu asli parantos dilakukeun pikeun ngirangan tingkat kasalahan nalika amplifikasi DNA.

RT-PCR

Reverse transcription PCR, atawa RT-PCR, ngamungkinkeun pamakéan RNA salaku citakan.Léngkah tambahan ngamungkinkeun deteksi sareng amplifikasi RNA.RNA ditranskripsi terbalik menjadi DNA komplementer (cDNA), menggunakan reverse transcriptase.Kualitas sarta purity tina citakan RNA penting pisan pikeun kasuksésan RT-PCR.Léngkah munggaran tina RT-PCR nyaéta sintésis hibrida DNA/RNA.Reverse transcriptase ogé ngagaduhan fungsi RNase H, anu ngaréduksi bagian RNA hibrida.Molekul DNA untai tunggal lajeng réngsé ku aktivitas DNA polimérase DNA tina reverse transcriptase kana cDNA.Efisiensi réaksi untaian kahiji tiasa mangaruhan prosés amplifikasi.Ti dieu, prosedur PCR standar dianggo pikeun ngagedékeun cDNA.Kamungkinan pikeun ngabalikeun RNA kana cDNA ku RT-PCR ngagaduhan seueur kauntungan, sareng utamina dianggo pikeun analisis éksprési gén.RNA mangrupa single-stranded sarta pohara teu stabil, nu ngajadikeun eta nangtang pikeun digawekeun ku.Biasana janten léngkah munggaran dina qPCR, anu ngitung transkrip RNA dina sampel biologis.

qPCR jeung RT-qPCR

PCR kuantitatif (qPCR) dianggo pikeun ngadeteksi, ngacirian sareng ngitung asam nukléat pikeun seueur aplikasi.Dina RT-qPCR, transkrip RNA sering diukur ku cara ngabalikkeun transkripsi kana cDNA heula, sakumaha anu dijelaskeun di luhur, teras qPCR saterasna dilaksanakeun.Sapertos dina PCR standar, DNA diamplifikasi ku tilu léngkah-léngkah: denaturasi, annealing, sareng elongasi.Nanging, dina qPCR, labél fluoresensi ngamungkinkeun ngumpulkeun data nalika PCR maju.Téhnik ieu ngagaduhan seueur mangpaat kusabab kisaran metode sareng kimia anu aya.

Dina qPCR dumasar-dye (biasana héjo), labél fluoresensi ngamungkinkeun kuantifikasi molekul DNA anu diamplifikasi ku ngagunakeun pewarna pengikat dsDNA.Salila unggal siklus, fluoresensi diukur.Sinyal fluoresensi ningkat sacara proporsional kana jumlah DNA anu direplikasi.Lantaran kitu, DNA diitung sacara "real-time" (Gbr. 3).Karugian tina qPCR dumasar dye nyaéta ngan ukur hiji udagan anu tiasa ditaliti dina hiji waktos sareng yén pewarna bakal ngabeungkeut kana sagala ds-DNA anu aya dina sampel.

Dina qPCR basis usik, loba target bisa dideteksi sakaligus dina unggal sampel, tapi ieu merlukeun optimasi jeung desain hiji usik target-spésifik (s) dipaké salian primers.Sababaraha jenis desain usik sadia, tapi tipe nu paling umum nyaéta usik hidrolisis, nu incorporates fluorofor jeung quencher.Mindahkeun énergi résonansi fluoresensi (FRET) nyegah émisi fluorophore liwat pamaen bari panyilidikan tetep utuh.Sanajan kitu, dina mangsa réaksi PCR, usik dihidrolisis salila extension primer jeung amplifikasi tina runtuyan husus eta kabeungkeut.Beulah usik misahkeun fluorophore ti quencher jeung hasil dina kanaékan amplifikasi-gumantung dina fluoresensi (Gbr. 4).Ku kituna, sinyal fluoresensi tina réaksi qPCR dumasar usik sabanding jeung jumlah runtuyan target usik hadir dina sampel.Kusabab qPCR basis usik leuwih spésifik ti qPCR basis dye, éta mindeng téhnologi dipaké dina assays diagnostik basis qPCR.

Amplifikasi Isothermal

Téhnik PCR anu disebatkeun di luhur ngabutuhkeun alat-alat thermocycling anu mahal pikeun sacara akurat naék sareng turun suhu kamar pikeun léngkah denaturasi, annealing, sareng ekstensi.Sajumlah téknik parantos dikembangkeun anu henteu peryogi alat anu tepat sapertos kitu sareng tiasa dilakukeun dina mandi cai anu sederhana atanapi bahkan dina sél anu dipikaresep.Téhnik ieu sacara koléktif disebut amplifikasi isothermal sareng dianggo dumasar kana amplifikasi eksponensial, linier, atanapi kaskade.

Jenis amplifikasi isothermal anu paling terkenal nyaéta amplifikasi isotermal anu dimédiasi loop, atanapi LAMP.LAMP ngagunakeun amplifikasi eksponensial dina 65⁰C pikeun ngagedékeun DNA template atanapi RNA.Nalika ngalakukeun LAMP, opat nepi ka genep primers pelengkap wewengkon DNA target dipaké ku DNA polimérase pikeun sintésis DNA anyar.Dua tina primer ieu gaduh sekuen pelengkap anu ngakuan sekuen dina primer anu sanés sareng ngabeungkeutna, ngamungkinkeun struktur "loop" kabentuk dina DNA anu nembé disintésis anu teras ngabantosan anil primer dina babak amplifikasi salajengna.LAMP tiasa ditingali ku sababaraha metode, kalebet fluoresensi, éléktroforésis gél agarose, atanapi kolorimétri.Gampangna visualisasi sareng ngadeteksi ayana atanapi henteuna produk ku kolorimétri sareng kurangna alat anu mahal ngajantenkeun LAMP janten pilihan anu cocog pikeun uji SARS-CoV-2 di daérah dimana tés laboratorium klinis henteu sayogi, atanapi neundeun sareng ngangkut conto. éta teu meujeuhna, atawa di laboratorium nu saméméhna teu boga alat thermocycling PCR.