Dasar desain primér (99% masalah tiasa direngsekeun)
1. Panjang Primer: Buku ajar merlukeun 15-30bp, biasana ngeunaan 20bp.Kaayaan saleresna langkung saé janten 18-24bp pikeun mastikeun spésifisitas, tapi langkung lami langkung saé, Primer panjang teuing ogé bakal ngirangan spésifisitas, sareng ngirangan ngahasilkeun.
2. rentang Gedekeun Primer: 200-500bp nyaeta luyu, sarta sempalan bisa dimekarkeun pikeun 10kb dina kaayaan husus.
3. Primer base: Eusi G + C kedah 40-60%, teuing saeutik G + C pangaruh amplifikasi teu alus, teuing G + C gampang muncul pita non-spésifik.ATGC paling hadé disebarkeun sacara acak, ngahindarkeun klaster nu leuwih ti 5 purin atawa pirimidin nukléotida.Multi-gc pikeun 5 'tungtung jeung urutan panengah pikeun ngaronjatkeun stabilitas, ulah GC euyeub di 3' tungtung, euweuh GC pikeun 3 basa panungtungan, atawa euweuh GC pikeun 3 tina 5 basa panungtungan.
4. Hindarkeun struktur sekundér dina primers, sarta ulah aya complementation antara dua primers, utamana complementation dina 3 'tungtung, disebutkeun dimer Primer bakal kabentuk sarta pita amplified non-spésifik bakal dihasilkeun.
5. Basa dina 3 'tungtung primers, utamana basa panungtungan sarta penultimate, kudu mastikeun dipasangkeun pikeun nyegah gagalna PCR alatan basa terminal unpaired.
6. Primer boga atawa bisa ditambahkeun jeung situs beulahan luyu, sarta runtuyan target amplified kedah preferably boga situs beulahan luyu, nu pisan mangpaatna pikeun analisis beulahan atawa kloning molekular.
7. spésifisitas primers: primers teu kudu boga homologi atra jeung runtuyan séjén dina database runtuyan asam nukléat.
8. Diajar ngagunakeun software: PP5, Oligo6, DNAstar, Véktor NTI, primer3 (Desain online ieu jalan pangalusna).
Eusi di luhur tiasa ngarengsekeun sahenteuna 99% masalah desain primer.
Kontrol detil desain primer
1. Panjang Primer
Panjang primer umum nyaéta 18 ~ 30 basa.Sacara umum, faktor anu paling penting pikeun nangtukeun suhu annealing primer nyaéta panjang primer.Suhu annealing primer umumna dipilih (nilai Tm -5 ℃), sareng sababaraha langsung nganggo nilai Tm.Rumus di handap ieu tiasa dianggo pikeun ngitung suhu annealing primer.
Lamun panjang primer kurang ti 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Lamun panjang Primer leuwih gede ti 20bp: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (% GC) -500 / panjangna-5 ℃
Sajaba ti éta, loba software ogé bisa dipaké pikeun ngitung suhu annealing, prinsip itungan bakal béda, jadi kadang nilai diitung bisa boga gap leutik.Pikeun ngaoptimalkeun réaksi PCR, primers pondok anu mastikeun suhu annealing teu kurang ti 54 ℃ dipaké pikeun efisiensi pangalusna sarta spésifisitas.
Gemblengna, spésifisitas primer ningkat ku faktor opat pikeun tiap nukléotida tambahan, sahingga panjang primer minimum pikeun kalolobaan aplikasi nyaéta 18 nukléotida.Wates luhur panjang primer teu penting pisan, utamana patali jeung efisiensi réaksi.Kusabab éntropi, beuki lila primer, nu handap laju di mana éta anneals ngabeungkeut DNA target pikeun ngabentuk template ganda-stranded stabil pikeun DNA polymerase ngabeungkeut.
Nalika nganggo parangkat lunak pikeun ngarancang primer, panjang primer tiasa ditangtukeun ku nilai TM, khususna pikeun primer PCR kuantitatif fluoresensi, TM = 60 ℃ atanapi langkung kedah dikontrol.
2. eusi GC
Sacara umum, eusi G + C dina urutan primer nyaéta 40% ~ 60%, sarta eusi GC jeung nilai Tm tina sapasang primers kudu koordinasi.Upami primer ngagaduhan kacenderungan GC atanapi AT anu serius, jumlah buntut A, T atanapi G sareng C anu pas tiasa ditambah kana tungtung 5' tina primer.
3. suhu Annealing
Suhu annealing kedah 5 ℃ langkung handap tina suhu unchain.Lamun jumlah basa primer leutik, suhu annealing bisa ngaronjat appropriately, nu bisa ningkatkeun spésifisitas PCR.Lamun jumlah basa badag, suhu annealing bisa ngurangan appropriately.Beda suhu annealing antara sapasang primers 4 ℃ ~ 6 ℃ moal mangaruhan ngahasilkeun PCR, tapi ideally suhu annealing tina sapasang primers sarua, nu bisa rupa-rupa antara 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Hindarkeun wewengkon struktur sekundér tina citakan amplifikasi
Hadé pisan mun éta ngahindarkeun wewengkon struktur sekundér citakan lamun milih sempalan amplified.Struktur sekundér stabil tina sempalan target bisa diprediksi jeung diperkirakeun ku software komputer relevan, nu mantuan pikeun pilihan template.Hasil ékspérimén nunjukkeun yén ékspansi sering gagal nalika énergi bébas (△G) daérah anu badé dilegaan kirang ti 58,6lkJ/mol.
5. Mmatch kalawan target DNA
Lamun urutan DNA target amplified badag, hiji primer bisa ngabeungkeut sababaraha bagian tina target DNA, hasilna sababaraha pita muncul dina hasilna.Waktos ieu kedah nganggo tés parangkat lunak BLAST, situs wéb:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Pilih Align two sequences (bl2seq).
Nempelkeun sekuen primer ka zona 1 sareng nargétkeun sekuen DNA ka zona 2 tiasa ditukeurkeun, sareng BLAST ngitung kamungkinan pelengkap, antisense, sareng kamungkinan sanés, janten pangguna henteu kedah perhatikeun naha duanana ranté mangrupikeun ranté rasa.Anjeun oge bisa ngasupkeun nomer GI lamun nyaho angka GI tina runtuyan dina database, jadi anjeun teu kudu nempelkeun bagian badag tina runtuyan.Tungtungna, klik Align di 3 pikeun nempo lamun primer boga sababaraha situs homologous dina target DNA.
6. terminal Primer
The 3 'tungtung Primer nyaeta dimana extension dimimitian, jadi hal anu penting pikeun nyegah mismatches ti dimimitian dinya.3 'tungtung teu kudu leuwih ti 3 padeukeut G atawa C, sabab ieu bakal ngabalukarkeun primer salah dipicu dina G + C wewengkon urutan pengayaan.Ujung 3 henteu tiasa ngabentuk struktur sekundér naon waé, kecuali dina réaksi PCR (AS-PCR) khusus, tungtung 3' tina primer henteu tiasa cocog.Contona, upami wewengkon encoding ieu amplified, 3 'tungtung Primer teu kudu terminated di posisi katilu tina kodon, sabab posisi katilu tina kodon rawan degenerate, nu bakal mangaruhan spésifisitas jeung efisiensi Gedekeun.Lamun maké primer anéksasi, tingal tabel pamakéan kodon, perhatikeun preferensi biologis, ulah maké primer anéksasi di tungtung 3′, sarta ngagunakeun konsentrasi luhur primers (1uM-3uM).
7. Struktur sekundér tina primers
Primer sorangan henteu kedah gaduh sekuen pelengkap, upami henteu, primers sorangan bakal ngalipet kana struktur jepit rambut, sareng struktur sekundér ieu bakal mangaruhan beungkeutan primer sareng template kusabab halangan sterik.Lamun judgment jieunan dipaké, dasar komplementer kontinyu tina primers sorangan teu kudu leuwih gede ti 3bp.Sakuduna euweuh complementarity antara dua primers, utamana tumpang tindihna komplementer tina 3 'tungtung kudu dihindari pikeun nyegah dibentukna dimer primer.Sacara umum, teu kudu aya leuwih ti 4 basa padeukeut homologi atawa complementarity antara pasangan primers.
8. Tambahkeun spidol atawa loci
Tungtung 5' boga pangaruh saeutik kana spésifisitas amplifikasi sahingga bisa dirobah tanpa mangaruhan spésifisitas amplifikasi.Modifikasi primér 5 'tungtung kaasup: nambahkeun situs pangwatesan énzim;Dilabélan biotin, fluoresensi, digoxin, Eu3+, jsb Ngenalkeun runtuyan DNA mengikat protéin;Ngenalkeun situs mutasi, nyelapkeun sareng leungit sekuen mutasi sareng ngenalkeun sekuen promoter, jsb. Dasar tambahan bakal langkung seueur mangaruhan efisiensi amplifikasi sareng ningkatkeun kasempetan formasi dimer primer, tapi sababaraha konsési kedah dilakukeun pikeun léngkah salajengna.Sekuen tambahan anu henteu aya dina sekuen udagan, sapertos situs larangan sareng sekuen promoter, tiasa ditambihan dina tungtung 5' primer tanpa mangaruhan spésifisitas.Runtuyan ieu teu kaasup kana itungan nilai Tm primer, tapi kudu diuji pikeun complementarity jeung struktur sekundér internal.
9. Subklon
Kalolobaan waktu, PCR ngan kloning awal, lajeng urang kudu subclone fragmen target kana rupa vektor, jadi urang kudu ngarancang basa tambahan pikeun operasi salajengna dina hambalan PCR.
Sababaraha runtuyan dirancang pikeun subcloning diringkeskeun di handap.
Watesan situs larangan endonuclease ditambahkeun
Nambahkeun situs larangan énzim mangrupikeun metode anu paling sering dianggo pikeun subkloning produk PCR.Sacara umum, situs beulahan genep basa, sajaba 5 'tungtung situs dibeulah deui kudu nambahan 2 ~ 3 basa pelindung.Tapi, jumlah basa pelindung anu dibutuhkeun ku énzim anu béda-béda béda.Contona, SalⅠ teu merlukeun base pelindung, EcoRⅤ merlukeun 1 basa pelindung, TeuⅠ merlukeun 2 basa pelindung, sarta Hind Ⅲ merlukeun 3 basa pelindung.
LIC nambihan buntut
Ngaran lengkep LIC nyaéta Ligation-Independent cloning, métode kloning invented by Navogen husus pikeun bagian na tina vektor pet.Pamawa pet disiapkeun ku métode LIC boga non-pelengkap 12-15 base single strand tungtung caket, nu ngalengkepan tungtung caket pakait dina fragmen sisipan target.Pikeun tujuan amplifikasi, urutan primer 5′ tina sempalan diselapkeun kedah ngalengkepan véktor LIC.Kagiatan extranect 3′→5′ T4 DNA polimérase bisa ngabentuk untaian tunggal tungtung caket dina sempalan diselapkeun sanggeus waktu anu singget.Kusabab produk ngan bisa ngawujud tina silih annealing tina sempalan sisipan disusun jeung vektor, metoda ieu pisan saum sareng efisien, sarta eta diarahkeun kloning.
Diarahkeun klon TA nambahkeun buntut
Kloning TA teu bisa nargétkeun fragmen jadi véktor, jadi engké Invitrogen ngenalkeun véktor nu bisa nargétkeun kloning, nu ngandung opat dasar GTGGS dina hiji tungtung.Ku alatan éta, dina desain primers PCR, runtuyan pelengkap kudu ditambahkeun sasuai, ku kituna fragmen bisa "berorientasi".
Upami anjeun pondok waktos, anjeun tiasa nyobian sintésis langsung, ngagabungkeun gén sareng vektor, anu kami sebut sintésis gén ET di musecularists.
D. Métode kloning In-Fusion
Taya ligase diperlukeun, euweuh réaksi panjang diperlukeun.Salami runtuyan dina duanana tungtung véktor liniér diwanohkeun Dina rarancang primers, produk PCR jeung véktor liniér ditambahkeun kana leyuran énzim in-fusion nu ngandung BSA jeung disimpen dina suhu kamar salila satengah jam, transformasi bisa dipigawé.Metoda ieu utamana cocog pikeun konversi volume badag.
10. Ngahiji Primer
Sakapeung, ngan informasi runtuyan kawates dipikawanoh ngeunaan desain primér.Contona, lamun ukur runtuyan asam amino dipikawanoh, Primer merging bisa dirancang.Primer ngahiji nyaéta campuran runtuyan anu béda-béda ngalambangkeun sakabéh kemungkinan basa anu béda anu ngodekeun hiji asam amino.Pikeun ningkatkeun spésifisitas, anjeun tiasa ningali tabel pamakean kodon pikeun ngirangan anéksasi dumasar kana kahoyong pamakean dasar organisme anu béda.Hypoxanthine bisa dipasangkeun kalayan sagala basa pikeun ngurangan suhu annealing tina primer.Ulah make basa dianéksasi di tungtung 3′ Primer sabab annealing tina 3 basa panungtungan dina tungtung 3′ cukup pikeun initiate PCR di situs salah.Konsentrasi primer anu leuwih luhur (1μM nepi ka 3μM) dipaké sabab primer dina loba campuran anéksasi henteu husus pikeun citakan sasaran.
bahan baku PCRkadali
1. kuantitas Primer
Konsentrasi unggal primer nyaéta 0.1 ~ 1umol atanapi 10 ~ 100pmol.Éta langkung saé pikeun ngahasilkeun hasil anu diperyogikeun kalayan jumlah primer panghandapna.Konsentrasi tinggi primer bakal ngabalukarkeun mismatch sarta amplifikasi non-spésifik, sarta ngaronjatkeun kasempetan ngabentuk dimer antara primers.
2. konsentrasi Primer
Konsentrasi primers mangaruhan spésifisitas.Konsentrasi primer optimal umumna antara 0,1 sareng 0,5μM.Konsentrasi primer anu langkung luhur ngakibatkeun amplifikasi produk nonspésifik.
3. Suhu Annealing of Primer
Parameter penting séjén pikeun primer nyaéta suhu lebur (Tm).Ieu suhu nalika 50% tina primers sareng sekuen komplementer digambarkeun salaku molekul DNA untai ganda.Tm diperlukeun pikeun nyetel suhu annealing PCR.Ideally, suhu annealing cukup low pikeun mastikeun annealing éféktif tina primers kalawan runtuyan target, tapi cukup luhur pikeun ngurangan beungkeutan nonspecific.Suhu annealing wajar tina 55 ℃ nepi ka 70 ℃.Suhu Annealing umumna diatur 5 ℃ leuwih handap Tm tina primer.
Aya sababaraha rumus pikeun netepkeun Tm, anu béda-béda pisan gumantung kana rumus anu dianggo sareng sekuen primer.Kusabab sabagéan ageung rumus masihan perkiraan nilai Tm, sadaya suhu anil ngan ukur titik awal.Spésifisitas bisa ditingkatkeun ku analisa sababaraha réaksi nu progressively naekeun suhu annealing.Mimitian sahandapeun estimasi Tm-5 ℃, sarta saeutik demi saeutik ningkatkeun suhu annealing dina increment 2 ℃.Suhu annealing anu langkung luhur bakal ngirangan formasi dimer primer sareng produk non-spésifik.Pikeun hasil anu pangsaena, dua primer kedah gaduh nilai Tm perkiraan.Lamun selisih Tm tina pasangan primer leuwih ti 5 ℃, primers bakal nembongkeun mimiti palsu signifikan ku ngagunakeun suhu annealing handap dina siklus.Lamun dua primers Tm béda, setel suhu annealing ka 5 ℃ leuwih handap tina Tm panghandapna.Alternatipna, pikeun ngaronjatkeun spésifisitas, lima siklus bisa dipigawé mimitina dina suhu annealing dirancang pikeun Tm luhur, dituturkeun ku siklus sésana dina suhu annealing dirancang pikeun Tm handap.Hal ieu ngamungkinkeun salinan parsial tina citakan tujuan pikeun diala dina kaayaan ketat.
4. purity Primer jeung stabilitas
Kamurnian standar tina primer khusus nyukupan pikeun kalolobaan aplikasi PCR.Ngaleungitkeun gugus benzoyl sareng isobutylyl ku cara desalting minimal sahingga henteu ngaganggu PCR.Sababaraha aplikasi merlukeun purifikasi pikeun miceun sagala urutan non-full-panjang dina prosés sintésis.Runtuyan truncated ieu lumangsung alatan efisiensi kimia sintésis DNA teu 100%.Ieu prosés sirkular anu ngagunakeun réaksi kimia nu terus-terusan sabab unggal basa ditambahkeun pikeun nyieun DNA tina 3' nepi ka 5'.Anjeun tiasa gagal dina boh siklus.Primer anu langkung panjang, khususna anu langkung ageung ti 50 basa, gaduh proporsi anu ageung tina sekuen anu dipotong sareng tiasa ngabutuhkeun purifikasi.
Ngahasilkeun primer dipangaruhan ku efisiensi kimia sintétik sareng metode purifikasi.Perusahaan biofarmaseutikal, sapertos Cytology sareng Shengong, sadayana nganggo unit OD minimum pikeun mastikeun total kaluaran oligonukleosida.Primer custom dikirimkeun dina bentuk bubuk garing.Hadé pisan mun éta ngabubarkeun deui primers dina TE supados konsentrasi ahirna 100μM.TE leuwih hade tinimbang cai deionisasi sabab pH cai mindeng asam sarta bakal ngabalukarkeun hidrolisis oligonucleosides.
Stabilitas primers gumantung kana kaayaan panyimpenan.bubuk garing sarta primers leyur kudu disimpen dina -20 ℃.Primer leyur dina TE dina konsentrasi leuwih gede ti 10μM bisa stably disimpen dina -20 ℃ salila 6 bulan, tapi ngan bisa disimpen dina suhu kamar (15 ℃ nepi ka 30 ℃) salila kurang ti 1 minggu.Primer bubuk garing tiasa disimpen dina -20 C salami sahenteuna 1 taun sareng dina suhu kamar (15 C dugi ka 30 C) dugi ka 2 bulan.
5. Énzim jeung konsentrasi maranéhanana
Ayeuna, Taq DNA polimérase anu dipaké dasarna nyaéta énzim rékayasa gén anu disintésis ku baktéri coliform.Jumlah énzim nu diperlukeun pikeun ngatalisan réaksi PCR has nyaeta ngeunaan 2.5U (ngarujuk kana total volume réaksi 100ul).Lamun konsentrasi teuing tinggi, éta bisa ngakibatkeun Gedekeun non-spésifik;lamun konsentrasi teuing low, jumlah produk sintétik bakal ngurangan.
6. Kualitas jeung konsentrasi dNTP
Kualitas dNTP raket patalina sareng konsentrasi sareng efisiensi amplifikasi PCR.Bubuk dNTP nyaeta granular, sarta variability na leungit aktivitas biologis na lamun ieu improperly disimpen.solusi dNTP nyaeta asam, sarta kudu dipake dina konsentrasi luhur, kalawan 1M NaOH atanapi 1M Tris.HCL solusi panyangga pikeun ngaluyukeun PH -na pikeun 7,0 ~ 7,5, jumlah leutik sub-bungkusan, gudang beku di -20 ℃.Sababaraha freeze-thawing bakal ngadegradasi dNTP.Dina réaksi PCR, dNTP kedahna 50 ~ 200umol/L.Utamana, perhatian kudu dibayar ka konsentrasi opat DNTPS kudu sarua (préparasi mol sarua).Upami konsentrasi salah sahijina béda ti anu sanés (luhur atanapi langkung handap), mismatch bakal disababkeun.Konsentrasi rendah teuing bakal ngirangan ngahasilkeun produk PCR.dNTP tiasa ngagabung sareng Mg2+ sareng ngirangan konsentrasi Mg2+ gratis.
7. Citakan (gén target) asam nukléat
Jumlah jeung darajat purifikasi asam nukléat citakan mangrupa salah sahiji tumbu konci pikeun kasuksésan atawa kagagalan PCR.Métode purifikasi DNA tradisional biasana ngagunakeun SDS sareng protease K pikeun nyerna sareng ngaleungitkeun spésimén.Fungsi utama SDS nyaéta: ngabubarkeun lipid jeung protéin dina mémbran sél, sahingga ngancurkeun mémbran sél ku ngabubarkeun protéin mémbran, sarta dissociate protéin nuklir dina sél, SDS ogé bisa ngagabungkeun jeung protéin sarta endapanana;Protéase K bisa ngahidrolisis jeung nyerna protéin, utamana histones kabeungkeut DNA, lajeng ngagunakeun fénol pangleyur organik jeung kloroform pikeun nimba protéin jeung komponén sél lianna, sarta ngagunakeun étanol atawa isopropil alkohol pikeun endapanana asam nukléat.Asam nukléat sasari bisa dipaké salaku citakan pikeun réaksi PCR.Pikeun spésimén deteksi klinis umum, métode gancang jeung basajan bisa dipaké pikeun ngabubarkeun sél, lysate patogén, nyerna jeung miceun protéin tina kromosom ngabebaskeun gén target, sarta langsung dipaké pikeun amplifikasi PCR.Ékstraksi citakan RNA biasana ngagunakeun guanidine isothiocyanate atawa métode protease K pikeun nyegah RNase ngahinakeun RNA.
Konsentrasi 8.Mg2+
Mg2+ gaduh pangaruh anu signifikan dina spésifisitas sareng ngahasilkeun amplifikasi PCR.Dina réaksi PCR umum, nalika konsentrasi rupa-rupa dNTP nyaeta 200umol/L, konsentrasi luyu Mg2+ nyaeta 1.5 ~ 2.0mmol/L.Konsentrasi Mg2 + teuing tinggi, spésifisitas réaksi turun, amplifikasi non-spésifik lumangsung, konsentrasi teuing low bakal ngurangan aktivitas Taq DNA polymerase, hasilna réduksi produk réaksi.
Ion magnésium mangaruhan sababaraha aspék PCR, kayaning aktivitas DNA polymerase, nu mangaruhan ngahasilkeun;Conto sanésna nyaéta annealing primer, anu mangaruhan spésifisitas.dNTP jeung citakan ngabeungkeut ion magnésium, ngurangan jumlah ion magnésium bébas diperlukeun pikeun aktivitas énzim.Konsentrasi ion magnésium optimal béda-béda pikeun pasangan primer sareng témplat anu béda, tapi konséntrasi awal PCR has sareng 200μM dNTP nyaéta 1,5mM (catetan: Pikeun PCR kuantitatif sacara real-time, paké solusi ion magnesium 3 dugi ka 5mM sareng usik fluoresensi).Konsentrasi ion magnésium bébas anu langkung luhur ningkatkeun ngahasilkeun, tapi ogé ningkatkeun amplifikasi nonspésifik sareng ngirangan kasatiaan.Pikeun nangtukeun konsentrasi optimal, titrations ion magnésium dipigawé dina increments 0.5mM ti 1mM ka 3mM.Pikeun ngurangan gumantungna kana optimasi ion magnésium, Platinum Taq DNA polymerase bisa dipaké.Platinum Taq DNA polymerase sanggup ngajaga fungsi dina rentang anu langkung lega konsentrasi ion magnésium ti Taq DNA polymerase sahingga peryogi kirang optimasi.
9. Pcr-promosi aditif
Optimasi suhu annealing, desain primer, jeung konsentrasi ion magnésium cukup pikeun amplifikasi kacida spésifik kalolobaan template;kumaha oge, sababaraha template, kaasup nu eusi GC tinggi, merlukeun ukuran tambahan.Aditif nu mangaruhan suhu lebur DNA nyadiakeun cara séjén pikeun ngaronjatkeun spésifisitas produk jeung ngahasilkeun.denaturasi pinuh ku citakan diperlukeun pikeun hasil pangalusna.
Salaku tambahan, struktur sekundér nyegah ngariung primer sareng ékspansi énzim.
Aditif PCR, kalebet formamide, DMSO, gliserin, betaine, sareng PCRx Enhancer Solution, ningkatkeun amplifikasi.Mékanismena mungkin nyaéta pikeun ngirangan suhu lebur, ku kituna ngabantosan anil primer sareng ngabantosan penyuluhan DNA polimérase ngalangkungan daérah struktur sekundér.Solusi PCRx boga kaunggulan sejenna.Optimasi ion magnésium minimal diperyogikeun nalika dianggo sareng polimérase DNA Platinum Taq sareng polimérase DNA Platinum Pfx.Ku kituna, téhnik Platinum digabungkeun jeung aditif pikeun ngaronjatkeun spésifisitas bari ngurangan gumantungna pendekatan katilu, optimasi ion magnésium.Pikeun hasil nu pangsaena, konsentrasi aditif kudu dioptimalkeun, utamana DMSO, formamide, jeung gliserol, nu ngahambat Taq DNA polymerase.
10. Mimitian panas
Panas mimiti PCR mangrupakeun salah sahiji metodeu pangpentingna pikeun ngaronjatkeun spésifisitas PCR salian desain primér alus.Sanajan suhu elongasi optimal Taq DNA polimérase nyaéta 72 ℃, polimérase tetep aktip dina suhu kamar.Ku kituna, produk non-spésifik dihasilkeun nalika suhu nyekel leuwih handap tina suhu annealing salila persiapan réaksi PCR sarta dina awal siklus termal.Sakali kabentuk, produk nonspésifik ieu sacara efektif diamplifikasi.Hot-start PCR utamana éféktif lamun situs dipaké pikeun rarancang primer diwatesan ku lokasi unsur genetik, kayaning mutasi situs-diarahkeun, kloning éksprési, atawa konstruksi jeung manipulasi elemen genetik dipaké pikeun rékayasa DNA.
Métode umum pikeun ngawates kagiatan Taq DNA polymerase nyaéta nyiapkeun solusi réaksi PCR dina és sareng nempatkeunna dina alat PCR anu dipanaskeun.Metoda ieu saderhana sareng murah, tapi henteu ngalengkepan kagiatan énzim sareng ku kituna henteu ngaleungitkeun amplifikasi produk non-spésifik.
Thermal priming ngalambatkeun sintésis DNA ku cara ngahambat komponén penting dugi ka alat PCR ngahontal suhu denaturasi.Paling métode inisiasi termal manual, kaasup nunda tambahan Taq DNA polymerase, pajeujeut, utamana pikeun aplikasi-throughput tinggi.Métode priming termal séjén ngagunakeun tameng lilin pikeun ngalampirkeun komponén penting, kaasup ion magnésium atawa énzim, atawa pikeun ngasingkeun fisik komponén réaktif, kayaning citakan jeung buffers.Salila siklus termal, rupa-rupa komponén dileupaskeun sarta dicampur babarengan salaku lilin lebur.Kawas metodeu mimiti panas manual, métode tameng lilin pajeujeut jeung rawan kontaminasi sarta henteu cocog pikeun aplikasi throughput tinggi.
Platinum DNA polimérase nyaéta merenah tur efisien keur otomatis panas mimiti PCR.Platinum Taq DNA polimérase diwangun ku rékombinan Taq DNA polimérase digabungkeun jeung antibodi monoklonal ngalawan Taq DNA polimérase.Antibodi dirumuskeun ku PCR pikeun ngahambat kagiatan énzim salami nahan suhu anu berkepanjangan.Taq DNA polimérase dileupaskeun kana réaksi salila insulasi 94 ℃ tina hambalan denaturasi, malikkeun aktivitas polimérase pinuh.Sabalikna sareng polimérase Taq DNA anu dirobih sacara kimia pikeun inisiasi termal, énzim Platinum henteu meryogikeun insulasi anu berkepanjangan dina 94 ℃ (10 dugi ka 15 menit) pikeun ngaktifkeun polimérase.Kalayan polimérase DNA PlatinumTaq, 90% kagiatan polimérase DNA Taq disimpen deui saatos 2 menit dina 94 ℃.
11. Sayang-PCR
Babak salajengna amplifikasi ngagunakeun primers nested tiasa ningkatkeun spésifisitas sareng sensitipitas.Babak kahiji mangrupikeun amplifikasi standar 15 dugi ka 20 siklus.A fraksi leutik tina produk amplifikasi awal diluted 100 nepi ka 1000 kali sarta ditambahkeun kana babak kadua amplifikasi pikeun 15 nepi ka 20 siklus.Alternatipna, produk awal amplified bisa ukuranana ku purifikasi gél.Primer nested dipaké dina babak kadua amplifikasi, nu bisa meungkeut runtuyan target di jero primer munggaran.Pamakéan PCR nested ngurangan kamungkinan amplifikasi sababaraha situs target sabab aya sababaraha runtuyan target pelengkap duanana susunan primers.Jumlah siklus anu sami (30 dugi ka 40) kalayan primer anu sami ngagedekeun situs anu henteu spésifik.PCR Nested ngaronjatkeun sensitipitas runtuyan target kawates (misalna mrnas langka) jeung ngaronjatkeun spésifisitas PCRS hésé (misalna 5′ RACE).
12. Turun PCR
Turun PCR ngaronjatkeun spésifisitas ku cara maké kaayaan annealing ketat pikeun sababaraha siklus mimiti PCR.Siklus dimimitian dina suhu annealing kira-kira 5 ℃ leuwih luhur ti estimasi Tm, lajeng unggal siklus diréduksi ku 1 ℃ ka 2 ℃ nepi ka suhu annealing handap Tm 5 ℃.Ngan citakan tujuan kalayan homologi pangluhurna bakal diamplifikasi.Produk ieu terus dilegakeun dina siklus saterusna, crowding kaluar produk nonspésifik amplified.Turun PCR mangpaat pikeun métode dimana darajat homologi antara primer jeung citakan target henteu dipikawanoh, kayaning sidik AFLP DNA.
Pakait PCR Kits
Pahlawan 2 × PCRTMSistim Campur boga kasabaran leuwih luhur pikeun sambetan PCR ti sistem PCR Campur biasa, sarta bisa kalayan gampang Cope jeung amplifikasi PCR rupa template kompléks.Sistem réaksi unik sareng efisiensi tinggi Taq Hero ngajantenkeun réaksi PCR gaduh efisiensi amplifikasi, spésifisitas sareng sensitipitas anu langkung luhur.
efisiensi amplifikasi luhur
Cai mibanda aktivitas 5'→3' DNA polimérase jeung 5'→3' aktivitas exonuclease, tanpa aktivitas exonuclease 3'→5'.
Nyata Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Héjo I Kit
Panyangga khusus-dioptimalkeun sareng énzim Taq mimiti panas tiasa nyegah amplifikasi non-spésifik sareng pembentukan dimer primer
Sensitipitas luhur-bisa ngadeteksi salinan low tina citakan
RT-PCR Easyᵀᴹ I (Salah Lengkah)
Kit éta ngagunakeun réagen transkripsi terbalik Foregene anu unik sareng Foregene HotStar Taq DNA Polymerase digabungkeun sareng sistem réaksi anu unik pikeun sacara efektif ningkatkeun efisiensi amplifikasi sareng spésifisitas réaksina.
waktos pos: May-09-2023
