Real Time PCR, ogé katelah PCR kuantitatif atanapi qPCR, mangrupikeun padika pikeun ngawaskeun waktos nyata sareng analisa produk amplifikasi PCR.
Kusabab PCR kuantitatif boga kaunggulan operasi basajan, gancang tur merenah, sensitipitas tinggi, repeatability alus, sarta laju kontaminasi low, éta loba dipaké dina nguji médis, assessment efficacy ubar, panalungtikan éksprési gén, panalungtikan transgenik, deteksi gén, deteksi patogén, sato jeung tutuwuhan deteksi., nguji dahareun jeung widang lianna.
Ku alatan éta, naha anjeun kalibet dina panalungtikan dasar dina élmu hirup, atawa karyawan pausahaan farmasi, pausahaan peternakan, pausahaan pangan, atawa malah karyawan inspeksi Éntri-kaluar jeung biro karantina, departemén ngawaskeun lingkungan, rumah sakit jeung unit séjén, anjeun bakal leuwih atawa kirang kakeunaan Atawa anjeun kudu nyaho pangaweruh mastering PCR kuantitatif.

Prinsip Real Time PCR

Real Time PCR mangrupikeun metode dimana zat fluoresensi ditambahkeun kana sistem réaksi PCR, sareng inténsitas sinyal fluoresensi dina prosés réaksi PCR dipantau sacara real waktos ku alat PCR kuantitatif, sareng tungtungna data ékspérimén dianalisis sareng diolah.

【Kurva amplifikasi】nyaéta kurva ngajéntrékeun prosés dinamis PCR.Kurva amplifikasi PCR saleresna sanes kurva eksponensial standar, tapi kurva sigmoid.

[Fase platform kurva amplifikasi]Kalayan paningkatan jumlah siklus PCR, inactivation of DNA polymerase, depletion of dNTPs sareng primers, sareng inhibisi réaksi sintésis ku réaksi pirofosfat produk samping, jsb, PCR henteu salawasna ngalegaan sacara éksponénsial., sarta ahirna bakal asup ka dataran.

[Wilayah Pertumbuhan Eksponénsial Kurva Amplifikasi]Sanajan fase dataran rupa-rupa greatly, di wewengkon nu tangtu wewengkon tumuwuhna éksponénsial tina kurva amplifikasi, repeatability pisan alus, nu pohara penting pikeun analisis kuantitatif PCR.

[Nilai ambang sareng nilai Ct]Urang nyetel nilai wates deteksi fluoresensi dina posisi luyu dina aréa tumuwuhna éksponénsial tina kurva amplifikasi, nyaéta nilai bangbarung (Threshold).Intersection tina nilai bangbarung jeung kurva amplifikasi nyaeta nilai Ct, nyaeta, nilai Ct nujul kana jumlah siklus (Threshold Cycle) nalika nilai bangbarung ngahontal.

Grafik di handap ieu jelas nunjukkeun hubungan antara garis bangbarung sareng kurva amplifikasi, bangbarung sareng nilai Ct.

【Kumaha ngitung?】

Geus dibuktikeun ku téori matematik yén nilai Ct boga hubungan linier tibalik jeung logaritma jumlah template awal.Real Time PCR ngawas produk amplifikasi PCR sacara real waktos sareng ngitungana salami fase amplifikasi eksponensial.

Pikeun unggal siklus PCR, DNA ngaronjat sacara éksponénsial ku 2 kali, sarta geura-giru ngahontal hiji dataran.

Anggap jumlah awal DNA nyaéta A₀ , sanggeus n siklus, jumlah téoritis produk DNA bisa ditembongkeun salaku:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Teras, langkung seueur jumlah DNA awal A 0, langkung gancang jumlah produk anu diamplifikasi ngahontal nilai deteksi An, sareng jumlah siklus nalika ngahontal An nyaéta nilai Ct.Hartina, beuki jumlah DNA awal A 0 nyaéta, saméméhna kurva amplifikasi puncak, sarta correspondingly jumlah diperlukeun siklus n leuwih leutik.

Kami ngalaksanakeun éncér gradién tina standar konsentrasi anu dipikanyaho sareng dianggo salaku témplat pikeun Real Time PCR, sareng séri kurva amplifikasi bakal dicandak dina interval anu sami dina urutan ngamimitian jumlah DNA tina langkung seueur ka kirang.Nurutkeun kana hubungan linier antara nilai Ct jeung logaritma jumlah template dimimitian, a[kurva standar] tiasa diciptakeun.

Ku substituting nilai Ct sampel kalawan konsentrasi kanyahoan kana kurva baku, jumlah template awal sampel kalawan konsentrasi kanyahoan bisa diala, nu prinsip kuantitatif Real Time PCR.

Métode deteksi Real Time PCR

Real Time PCR ngadeteksi produk amplifikasi PCR ku cara ngadeteksi inténsitas fluoresensi dina sistem réaksi.

Prinsip Metode Embedding Pewarna Fluoresensi】

Pewarna fluoresensi, kayaning TB Green ® , bisa nonspecifically ngabeungkeut DNA ganda-stranded dina sistem PCR sarta fluoresce kana mengikat.

Inténsitas fluoresensi dina sistem réaksi ningkat sacara éksponénsial kalayan ningkatna siklus PCR.Ku ngadeteksi inténsitas fluoresensi, jumlah amplifikasi DNA dina sistem réaksi tiasa dipantau sacara real waktos, teras jumlah template awal dina sampel tiasa ditaksir sabalikna.

【Prinsip metoda usik fluoresensi】

usik fluoresensimangrupakeun runtuyan asam nukléat jeung grup fluoresensi dina 5 'tungtung sarta gugus quenching di 3' tungtung, nu husus bisa ngabeungkeut template.Nalika usik gembleng, fluoresensi anu dipancarkeun ku fluorophore dipareuman ku gugus quenching sareng teu tiasa fluoresce.Nalika usik di decomposed, zat fluoresensi bakal dissociate sarta emit fluoresensi.

A usik fluoresensi ditambahkeun kana solusi réaksi PCR.Salila prosés annealing, usik fluoresensi bakal ngabeungkeut posisi husus tina citakan.Salila prosés extension, aktivitas exonuclease 5′→3′ énzim PCR bisa decompose usik fluoresensi hibridisasi jeung citakan, sarta zat fluoresensi dissociated mun emit fluoresensi.Ku ngadeteksi inténsitas fluoresensi usik dina sistem réaksi, tujuan ngawaskeun jumlah amplifikasi produk PCR tiasa dihontal.

【Pamilihan Métode Deteksi Fluoresensi】

Upami dianggo pikeun ngabédakeun sekuen kalayan homologi anu luhur sareng ngalaksanakeun deteksi PCR multipleks sapertos analisa ngetik SNP, metode usik fluoresensi henteu tiasa diganti.
Pikeun ékspérimén PCR Real Time anu sanés, metode chimera fluoresensi anu sederhana, gampang sareng béaya rendah tiasa dianggo.

ProbesSpésifisitas kuat, sanggup PCR multiplex

Kakurangan

syarat spésifisitas tinggi pikeun amplifikasi;

multiplex PCR teu bisa dipigawéPerlu ngarancang panyilidikan husus, ongkos tinggi;

kadang desain usik hese

Produk patali: