RT-qPCR teh percobaan dasar biologi molekular, jeung dulur kudu wawuh jeung eta.Utamana ngawengku tilu léngkah: ékstraksi RNA, transkripsi sabalikna kana cDNA, sarta PCR kuantitatif fluoresensi real-time.Éta henteu ngabantosan, naon anu lumangsung?Eta kamungkinan yén aya masalah jeungpercobaan transkripsi sabalikna!Sanajan sigana percobaan transkripsi sabalikna ngan perlu nambahkeun RNA, dNTP, primers, jeungreverse transcriptasekana tube centrifuge tur gaul ogé, tapi dina prosés operasi sabenerna, aya kénéh loba rinci anu kudu nengetan.Hayu urang diajar ngeunaan eta!

Kumaha nangtoskeun kualitas RNA?
Pikeun ménta cDNA, kualitas RNA kritis!Kualitas RNA bisa dideteksi utamana tina dua aspék:
(1) Integritas RNA:Integritas RNA bisa diverifikasi ku éléktroforésis gél agarose. Misalkeun eukariot, total RNA lengkep boga tilu pita jelas, beurat molekular ti badag nepi ka leutik nyaéta 28S, 18S, jeung 5S, sarta 28S dua kali caang ti 18S;lamun tilu pita bisa ditempo, tapi tipe pita kabur atawa Difusi hartina RNA sawaréh didegradasi.Dina waktos ayeuna, punten laksanakeun réaksi transkripsi ngabalikeun langsung sareng ningkatkeun input citakan kalayan leres;Upami ngan ukur pita anu beurat molekulna leutik atanapi henteu aya pita anu tiasa katingali, RNA parantos didegradasi lengkep sareng kedah diekstraksi deui.Agilent 2100 nunjukkeun integritas RNA kalayan diagram puncak sareng nilai RIN.Lamun asam nukléat gembleng, dasar tina electropherogram datar;upami asam nukléat parah didegradasi, dasarna henteu rata sareng langkung seueur puncak degradasi muncul;nilai RIN ngagambarkeun integritas RNA, dina rentang 0-10, nu leuwih gede nilai, nu hadé kualitas RNA.Tah, beuki luhur darajat kasampurnaan.
(2) Kemurnian RNA:Babandingan OD260/280 tiasa dideteksi ku spéktrofotometri UV.Lamun babandingan OD260/280 nyaeta antara 1,9 jeung 2,1, purity pisan alus.
Sisa DNA génomik bisa ngakibatkeun hasil kuantitatif teu akurat
Nalika RNA diekstrak, RNA anu urang kéngingkeun tiasa dicampur sareng DNA génomik (gDNA) anu teu acan dibersihkeun.Ku alatan éta, cDNA sanggeus transkripsi sabalikna ogé bakal dicampurkeungDNA.Mangsa hilirqPCRréaksi,cDNAjeung gDNA bisa jadi amplified sakaligus, hasilna nilai CT relatif leutik, jadi hasilna bisa jadi bias.
Janten naon anu kedah urang laksanakeun dina kaayaan ieu?Foregenenyarankeun:
(1) Ngalakukeun beberesih génom dina RNA tibalik, nu bisa dihapus ku ékstraksi kolom salila ékstraksi RNA;
(2) Ngubaran RNA anu diekstrak ku DNaseI , tapi mungkas ku EDTA;
reagen transkripsi terbalikkalawan modul clearing génom;

Kumaha carana milih primers pikeun transkripsi sabalikna?
Primer transkripsi sabalikna ogé mangaruhan hasil tina réaksi transkripsi sabalikna.Anjeun tiasa milih primer acak, Oligo dT atanapi primer khusus gén pikeun transkripsi sabalikna dumasar kana kaayaan spésifik percobaan:
(1) Transkrip husus: primers gén-spésifik dianjurkeun;
(2) Transkrip sempalan panjang: Primer oligo dT/gen-spésifik disarankeun;
(3) Sempalan internal tina transkrip ségmén panjang: Primer spésifik gén/ primer acak / primer acak + Oligo dT.Lamun percobaan qPCR saterusna dipigawé, Oligo dT teu bisa dipaké nyalira, sabab ngagunakeun Oligo dT nyalira bisa ngabalukarkeun 3′ tungtung bias, ngarah kana hasil percobaan qPCR taliti;
(4) miRNA: Primer batang-loop atawa primer tailing bisa dipaké.

Sabaraha kali cDNA produk transkripsi sabalikna kedah éncér pikeun kuantifikasi?
Saatos nampi cDNA produk transkripsi sabalikna, sabaraha kali cDNA kedah éncér pikeun percobaan qPCR penting pisan.Upami konsentrasi cDNA luhur teuing atanapi rendah teuing, efisiensi amplifikasi tiasa kapangaruhan.Naha konsentrasi cDNA tiasa diukur, sareng kumaha kedah dilakukeun?
(1) Konsentrasi cDNA produk transkripsi sabalikna teu bisa diukur, sabab salian produk cDNA, produk transkripsi sabalikna ogé ngandung reverse transcription residual Buffer, reverse transcriptase, primers, jsb, nu bakal ngaganggu hasil pangukuran konsentrasi sarta ngabalukarkeun OD260/280, OD260/280, OD260/230, rasio c.DNA teu ngagambarkeun abnormal bener.Dina waktu ieu, sababaraha babaturan bakal nyebutkeun, lajeng abdi bakal ngukur konsentrasi sanggeus purifikasi;Ieuh,Foregene hoyong ngingetkeun yén cDNA henteu dianjurkeun pikeun dimurnikeun, sabab panjang cDNA diala ku ngabalikeun béda, sarta cDNA pondok bakal leungit dina purifikasi nu.
(2) Janten naon anu kedah dilakukeun?Saméméh ékspérimén qPCR, gradién éncér cDNA bisa ditangtukeun ngaliwatan pra-ékspérimén.Contona: make solusi stock cDNA, éncér 10-melu, jeung éncér 100-melu salaku citakan pikeun percobaan qPCR, tur pilih faktor éncér kalayan nilai CT dina rentang 18-28.

Kumaha miRNAs kedah ditranskripsi balik?
miRNA nyaéta RNA molekul leutik untaian tunggal kalayan ukuran kira-kira 22 nt anu henteu kode pikeun protéin.Kusabab panjangna pondok, metoda qPCR konvensional hese langsung ngitung eta, jadi mindeng perlu manjangkeun miRNA;métode transkripsi sabalikna nu ilahar dipaké pikeun miRNA ngawengku métode stem-loop jeung métode tailing.
Métode stem-loop nyaéta manjangkeun miRNA ku cara nambahkeun primers stem-loop.Métode deteksi ieu ngagaduhan sensitipitas sareng spésifisitas anu langkung luhur, tapi throughput deteksi rendah.Hiji transkripsi sabalikna ngan bisa ngadeteksi hiji miRNA jeung hiji rujukan internal;métode tail-adding diwangun ku dua Ieu réngsé ku aksi gabungan dua énzim, nu PolyA polymerase jeung reverse transcriptase.Polimérase PolyA tanggung jawab pikeun nambahkeun buntut PolyA kana miRNA pikeun nambahan panjangna, sarta transkripse balik ngalakukeun réaksi transkripsi sabalikna.Metoda ieu gaduh throughput deteksi anu luhur sareng tiasa ngadeteksi sababaraha miRNA sareng referensi internal dina hiji transkripsi sabalikna, tapi sensitipitas sareng spésifisitas rendah dina metode loop-stang.