Sarerea geus ngawangkong ngeunaan prinsip qRT-PCR percobaan, desain primér, interpretasi hasil, jeung sajabana, tapi kuring pikir kuring kudu babagi sareng anjeun operasi eksperimen qRT-PCR.Ieu leutik, tapi ngeunaan hasil.

Sateuacan ngalakukeun qRT-PCR, urang kedah gaduh pamahaman anu jelas ngeunaan RNA sareng metode operasi urang sorangan.Barina ogé, usaha urang ditujukeun pikeun kéngingkeun hasil, sanés ngan ukur latihan.Janten sateuacan ngalakukeun qRT-PCR, urang kedah nangtukeun masalah-masalah di handap ieu (sababaraha di antarana ngan ukur tiasa dianggo pikeun SYBR).

1 Naha anjeun yakin yén RNA anjeun henteu terdegradasi?

NanoDrop 2000 ngan ukur tiasa ngadeteksi konsentrasi sareng kamurnian RNA, tapi henteu tiasa ngadeteksi integritas RNA.

Nilai RNA (RNA Intesity Number) tiasa ngagambarkeun integritas RNA, anu dideteksi ku sistem Agilent 2100 Bioanalyzer.

Gbr. Diagram skematis nilai RIN untuk sampel RNA yang berbeda (eukariota)

Nanging, laboratorium umumna henteu gaduh Agilent 2100 Bioanalyzer.Dina hal ieu, urang bisa ngadeteksi ngaliwatan gél formaldehida, tapi sarat pikeun jumlah total RNA tinggi, jadi metoda panggancangna nyaéta ngagunakeun éléktroforésis gél biasa.Ieu diperlukeun pikeun jadi di lingkungan nuclease bébas, jadi perlu bilas tank éléktroforésis, botol sol, bracket gél jeung sisir jeung cai DEPC.Agarose ogé bebas nuklease (salami dibuka anyar), sarta panyangga Loading kudu dibuka saloba mungkin, kalawan gél 1,2%.

Catet yén gél kudu sagemblengna leyur, disebutkeun eta bakal ngabalukarkeun pita inhomogeneous, ditémbongkeun saperti dina sampel 9 dina gambar.Lamun tegangan teuing tinggi atawa ngajalankeun pikeun lila teuing bakal ngahasilkeun panas sarta ngabalukarkeun degradasi RNA, jadi tegangan jeung waktu kudu dikawasa alesan.Sajaba ti éta, gél ngajalankeun ogé bisa salajengna nangtukeun naha aya résidu DNA dina sampel, sarta niténan naha aya angka nu gede ngarupakeun pita dipikagaduh dina dispensing sumur.

Angka.Éléktroforésis gél deteksi RNA

2 Naha anjeun yakin kana konsentrasi cDNA anjeun?

Pangalaman baraya ageung di laboratorium nyaéta yén cDNA tina sistem 20 ul anu dicandak ku unggal inversi langsung éncér 20X, sedengkeun sadulur postdoktor éncér 10X.Kuring biasana gumantung kana kaayaan.Kusabab kualitas RNA anu disebatkeun ku unggal jalma béda-béda, tingkat ngabalikeun ogé béda, sareng téknologi ngabalikeun tiasa henteu stabil.

Janten unggal waktos kuring kéngingkeun cDNA anu dibalikkeun, kuring bakal éncér heula kira-kira 3 kali, teras nganggo gen housekeeping pikeun ngalakukeun RT-PCR, jumlah siklus umumna 25 siklus, pikeun ngaidentipikasi konsentrasi khusus, teras nangtukeun faktor éncér akhir.

3 Naha anjeun yakin yén primer anjeun gampang dianggo?

Bisa lulus kurva lebur of qRT-PCR, tapi ieu masih waragad duit.Pikeun laboratorium tanpa loba duit, nalika aranjeunna meunang loba primers, aranjeunna tiasa nganggo RT-PCR biasa pikeun nempo lamun éta band tunggal jeung nangtukeun spésifisitas tina primers.Lamun laboratorium teu kakurangan duit, spésifisitas sadaya primers bisa dicirikeun sakali ngaliwatan kurva lebur.

4 Naha anjeun yakin yén kaayaan ékspérimén anjeun cocog?

SYBR kudu ditangtayungan tina lampu nu kuat, jadi coba mareuman lampu overhead nalika nambahkeun réagen SYBR, sarta ngan perlu make lampu taram pikeun ngalengkepan éta.

Simpen SYBR dina suhu 4°C.Lamun dipake, gently invert ka luhur jeung ka handap pikeun mix ogé ulah foaming, sarta ulah vortex vigorously.

Sababaraha adina resep ngagambar tanda dina papan PCR kusabab sieun nyampur sampel, anu salah.Kusabab spidol anjeun kamungkinan pisan mangaruhan kumpulan sinyal fluoresensi, kuring umumna nyarankeun juniors ngagunakeun notebook ékspérimén pikeun mantuan dina memori, ditémbongkeun saperti di handap ieu.

Angka.qRT-PCR sampel loading diagram

5 Naha anjeun yakin yén anjeun ngalakukeun éta leres?

Pastikeun maké sarung, maké sarung, maké sarung, sarta ngomong hal penting tilu kali.

Dina raraga ngurangan paparan SYBR ka lampu, abdi pribadi resep nambahkeun template munggaran, ditémbongkeun saperti dina gambar di handap ieu.Numutkeun pangalaman, tambihan jumlah leutik template kamungkinan ngabalukarkeun kasalahan sampling.Ku alatan éta, dina raraga ngaleutikan kasalahan disababkeun ku nambahkeun jumlah leutik template, Kuring biasana ganda sampel deui, sarta ganda jumlah nalika nambahkeun sampel pikeun ngurangan jumlah H2O2 ditambahkeun.

Angka.diagram Schematic of qRT-PCR loading

Lajeng ngonpigurasikeun sistem qRT-PCR saperti kieu.

Angka.diagram persiapan sistem qRT-PCR

CATETAN: Prosés konfigurasi perlu dipigawé dina és.

Saatos nambahkeun sampel, nempelkeun film sealing transparan.Coba teu noél beungeut film sealing transparan jeung leungeun Anjeun, ngan beroperasi ti rohangan dina dua sisi film.Kusabab sidik ogé bisa mangaruhan kumpulan sinyal fluoresensi.Lajeng nganggo centrifuge a gancang centrifuge pikeun 10 s dina speed low pikeun nyegah sampel tina ngagantung dina témbok.

Produk patali:

Sél langsung RT-qPCR kit

RT Gampang II