RT-qPCR dikembangkeun tina téknologi PCR biasa.Éta nambihan bahan kimia fluoresensi (pewarna fluoresensi atanapi panyilidikan fluoresensi) kana sistem réaksi PCR tradisional, sareng ngadeteksi prosés annealing sareng extension PCR sacara real waktos dumasar kana mékanisme luminescent anu béda.Parobahan sinyal fluoresensi dina médium dipaké pikeun ngitung jumlah parobahan produk dina unggal siklus PCR.Ayeuna, metode anu paling umum nyaéta metode pewarna fluoresensi sareng metode usik.

Metoda ngawarnaan fluoresensi:
Sababaraha dyes fluoresensi, kayaning SYBR Héjo Ⅰ, PicoGreen, BEBO, jsb, teu emit lampu ku sorangan, tapi emit fluoresensi sanggeus ngariung kana alur minor dsDNA.Ku alatan éta, dina awal réaksi PCR, mesin teu bisa ngadeteksi sinyal fluoresensi.Nalika réaksi lumangsung kana annealing-extension (metode dua-lengkah) atawa tahap extension (metode tilu-hambalan), untaian ganda dibuka dina waktu ieu, sarta polimérase DNA anyar Salila sintésis untaian, molekul fluoresensi digabungkeun dina alur minor dsDNA sarta emit fluoresensi.Nalika jumlah siklus PCR naek, beuki loba dyes ngagabungkeun jeung dsDNA, sarta sinyal fluoresensi ogé terus ditingkatkeun.Candak SYBR Green Ⅰ sabagé conto.
Métode Probe:
usik Taqman nyaéta usik hidrolisis anu paling sering dianggo.Aya grup fluoresensi dina tungtung 5′ usik, biasana FAM.usik sorangan mangrupakeun runtuyan pelengkap gén target.Aya grup quenching fluoresensi dina tungtung 3′ fluorofor.Nurutkeun kana prinsip mindahkeun énergi résonansi fluoresensi (Förster résonansi mindahkeun énergi, FRET), nalika reporter group fluoresensi (donor molekul fluoresensi) jeung quenching grup fluoresensi (acceptor fluoresensi molekul) Nalika spéktrum éksitasi tumpang tindih jeung jarakna deukeut pisan (7-10nm), éksitasi tina molekul fluoresensi lemah, nu autoscitasi tina fluoresensi fluoresensi. ned.Ku alatan éta, dina awal réaksi PCR, nalika usik bébas tur gembleng dina sistem, grup fluoresensi reporter moal emit fluoresensi.Nalika annealing, Primer jeung usik ngabeungkeut template.Salila tahap extension, polimérase terus sintésis ranté anyar.DNA polimérase miboga aktivitas exonuclease 5′-3′.Nalika ngahontal usik, polimérase DNA bakal ngahidrolisis usik tina citakan, misahkeun grup fluoresensi reporter ti grup fluoresensi quencher, sarta ngaleupaskeun sinyal fluoresensi.Kusabab aya hubungan hiji-ka-hiji antara usik jeung citakan, metoda usik téh punjul ti metoda ngalelep dina hal akurasi sarta sensitipitas tina tés.

Gbr 1 Prinsip qRT-PCR

Desain Primer
Prinsip:

Primer kudu dirancang di wewengkon konservasi runtuyan asam nukléat sarta boga spésifisitas.

Hadé pisan mun éta ngagunakeun runtuyan cDNA, sarta runtuyan mRNA ogé bisa ditarima.Lamun henteu, panggihan desain wewengkon cds runtuyan DNA.
Panjang produk kuantitatif fluoresensi nyaéta 80-150bp, pangpanjangna nyaéta 300bp, panjang primer umumna antara 17-25 basa, sareng bédana antara primer hulu sareng hilir henteu kedah ageung teuing.

Eusi G + C antara 40% sareng 60%, sareng 45-55% mangrupikeun anu pangsaéna.
Nilai TM antara 58-62 derajat.
Coba ulah dimer Primer jeung dimer diri, (ulah muncul leuwih ti 4 pasang basa pelengkap padeukeut) struktur hairpin, upami teu bisa dihindari, nyieun ΔG<4.5kJ/mol* Lamun teu bisa mastikeun yén gDNA geus dihapus salila transkripsi sabalikna Bersih, éta pangalusna pikeun ngarancang primers tina intron * 3′ tungtung teu bisa nyingkahan struktur AT, 3′ kontinyu, AT, A/GC, tur euyeub tur euyeub tur teu bisa dirobah. ) primers jeung non-
husus Homologi runtuyan hétérogén diamplifikasi preferably kirang ti 70% atawa boga 8 homologi basa komplementer.
pangkalan data:
CottonFGD milarian ku kecap konci
Desain primér:
Desain primér IDT-qPCR

Gbr2 IDT online halaman alat desain primér

Gbr3 tampilan kaca hasil
Desain primer lncRNA:
lncRNA:léngkah anu sami sareng mRNA.
miRNA:Prinsip metoda stem-loop: Kusabab sakabeh miRNAs mangrupakeun runtuyan pondok ngeunaan 23 nt, deteksi PCR langsung teu bisa dipigawé, jadi alat runtuyan stem-loop dipaké.Runtuyan stem-loop nyaéta DNA untaian tunggal kira-kira 50 nt, nu bisa ngabentuk struktur jepit rambut ku sorangan.3 'Tungtungna tiasa dirarancang salaku sekuen pelengkap kana sempalan parsial miRNA, teras target miRNA tiasa dihubungkeun sareng sekuen sirung-loop salami transkripsi sabalikna, sareng total panjangna tiasa ngahontal 70bp, anu saluyu sareng panjang produk anu diamplifikasi anu ditangtukeun ku qPCR.Desain primér miRNA buntut.
Deteksi spésifik amplifikasi:
Database blast online: CottonFGD blast ku runtuyan kasaruaan
Blast lokal: Tingali nganggo Blast + pikeun ngalakukeun blast lokal, linux sareng macos tiasa langsung ngadamel database lokal, sistem win10 ogé tiasa dilakukeun saatos masang ubuntu bash.Jieun database blast lokal jeung blast lokal;buka ubuntu bash dina win10.
Perhatikeun: Kapas dataran luhur sareng kapas pulo laut mangrupikeun pepelakan tetraploid, janten hasil ledakan sering janten dua patandingan atanapi langkung.Baheula, ngagunakeun cd NAU salaku database pikeun ngalakukeun blast kamungkinan manggihan dua gén homolog jeung ngan sababaraha béda SNP.Biasana, dua gén homolog teu tiasa dipisahkeun ku desain primer, ku kituna aranjeunna diperlakukeun sami.Mun aya hiji indel atra, Primer biasana dirancang dina indel, tapi ieu bisa ngakibatkeun struktur sekundér Primer Énergi bébas jadi luhur, ngarah kana panurunan dina efisiensi amplifikasi, tapi ieu teu bisa dihindari.

Deteksi struktur sekundér primer:
Léngkah-léngkah:buka oligo 7 → urutan citakan input → tutup sub-jandela → simpen → nomeran lokasi primer on citakan, pencét ctrl + D pikeun ngeset panjang primer → nganalisis rupa struktur sekundér, kayaning awak dimerisasi diri, heterodimer, hairpin, mismatch, jsb Dua gambar panungtungan dina Gambar 4 mangrupa hasil tés tina primers.Hasil tina Primer hareup téh alus, euweuh dimer atra tur struktur hairpin, euweuh basa pelengkap kontinyu, sarta nilai mutlak énergi bébas nyaéta kirang ti 4,5, sedengkeun Primer deui nembongkeun kontinyu The 6 basa anu pelengkap, sarta énergi bébas nyaéta 8,8;Sajaba ti éta, hiji dimer langkung serius mucunghul dina 3 'tungtung, sarta dimer tina 4 basa padeukeut mucunghul.Sanaos énergi bébas henteu luhur, 3′ dimer Chl tiasa mangaruhan sacara serius spésifisitas amplifikasi sareng efisiensi amplifikasi.Sajaba ti éta, perlu mariksa hairpins, heterodimers, sarta mismatches.

Gbr3 hasil deteksi oligo7
Deteksi efisiensi amplifikasi:
Efisiensi amplifikasi réaksi PCR mangaruhan sacara serius kana hasil PCR.Ogé dina qRT-PCR, efisiensi amplifikasi penting pisan pikeun hasil kuantitatif.Leupaskeun zat séjén, mesin jeung protokol dina panyangga réaksi.Kualitas primer ogé gaduh pangaruh anu ageung kana efisiensi amplifikasi qRT-PCR.Pikeun mastikeun katepatan hasil, boh kuantifikasi fluoresensi relatif sareng kuantifikasi fluoresensi mutlak kedah ngadeteksi efisiensi amplifikasi primer.Diakuan yén efisiensi amplifikasi qRT-PCR anu efektif nyaéta antara 85% sareng 115%.Aya dua cara:
1. Métode kurva baku:
a.Campur cDNA
b.Éncér gradién
c.qPCR
d.Persamaan régrési linier pikeun ngitung efisiensi amplifikasi
2. LinRegPCR
LinRegPCR mangrupikeun program pikeun nganalisis Data RT-PCR waktos nyata, ogé disebut data PCR kuantitatif (qPCR) dumasar kana SYBR Green atanapi kimia anu sami.Program ngagunakeun data anu teu dilereskeun dasar, ngalaksanakeun koréksi dasar dina unggal sampel Kapisah, nangtukeun jandela-linearitas teras nganggo analisis régrési linier pikeun nyocogkeun garis lempeng ngaliwatan set data PCR.Ti lamping garis ieu efisiensi PCR unggal sampel individu diitung.Efisiensi PCR rata-rata per amplicon jeung nilai Ct per sampel dipaké pikeun ngitung konsentrasi awal per sampel, dinyatakeun dina unit fluoresensi sawenang.Input sareng kaluaran data ngalangkungan spreadsheet Excel.Ngan sampel
Pergaulan diperlukeun, euweuh gradién
léngkah diperlukeun:(Candak Bole CFX96 sabagé conto, teu cukup Mesin kalawan ABI jelas)
percobaan:éta percobaan qPCR baku.
kaluaran data qPCR:LinRegPCR tiasa mikawanoh dua bentuk file kaluaran: RDML atanapi kuantitas hasil Amplifikasi.Nyatana, éta mangrupikeun nilai deteksi sacara real-time tina jumlah siklus sareng sinyal fluoresensi ku mesin, sareng amplifikasi dimeunangkeun ku nganalisa nilai parobahan fluoresensi tina efisiensi ruas linier.
Pamilihan data: Dina tiori, nilai RDML kedah tiasa dianggo.Diperkirakeun yén masalah komputer kuring nyaéta yén parangkat lunak henteu tiasa mikawanoh RDML, janten kuring gaduh nilai kaluaran Excel salaku data asli.Disarankeun pikeun ngalakukeun saringan kasar data heula, sapertos gagalna nambihan conto, jsb. Titik tiasa dihapus dina data kaluaran (tangtosna, anjeun moal tiasa ngahapus aranjeunna, LinRegPCR bakal malire titik ieu dina tahap salajengna).

Gbr5 ékspor data qPCR

Gambar 6 pilihan sampel calon

Input data:Buka hasil amplifikasi kualifikasi.xls, → buka LinRegPCR → file → baca tina excel → pilih parameter sapertos anu dipidangkeun dina Gambar 7 → OK → klik nangtukeun garis dasar

Gbr7 léngkah input data linRegPCR

Hasilna:Upami teu aya pangulangan, teu kedah dikelompokkeun.Upami aya pengulangan, pengelompokan tiasa diedit dina pengelompokan sampel, sareng nami gén diasupkeun dina identifier, teras gén anu sami bakal otomatis dikelompokkeun.Tungtungna, klik dina file, ékspor Excel, sareng ningali hasilna.Efisiensi amplifikasi sareng hasil R2 unggal sumur bakal ditingalikeun.Kadua, upami anjeun ngabagi grup, efisiensi amplifikasi rata-rata anu dilereskeun bakal ditingalikeun.Pastikeun efisiensi amplifikasi unggal primer antara 85% sareng 115%.Upami ageung teuing atanapi alit teuing, éta hartosna efisiensi amplifikasi primer kirang.

Gbr 8 Hasil sareng kaluaran data

Prosés ékspérimén:
Syarat kualitas RNA:
Kamurnian:1.72.0 nunjukkeun yén meureun aya isothiocyanate residual.Asam nukléat bersih A260 / A230 kedah sakitar 2 .Upami aya nyerep anu kuat dina 230 nm, éta nunjukkeun yén aya sanyawa organik sapertos ion phenate.Salaku tambahan, éta tiasa dideteksi ku éléktroforésis gél agarose 1,5%.Tunjukkeun pananda, sabab ssRNA teu boga denaturasi jeung logaritma beurat molekul teu boga hubungan linier, sarta beurat molekul teu bisa dikedalkeun bener.Konsentrasi: Téoritishenteukirang ti 100ng / ul, lamun konsentrasi teuing low, purity umumna low teu jangkung

Gambar 9 RNA gél

Sajaba ti éta, lamun sampel téh adi jeung konsentrasi RNA tinggi, eta disarankeun pikeun aliquot eta sanggeus ékstraksi, sarta éncér RNA ka konsentrasi ahir 100-300ng / ul pikeun transkripsi sabalikna.Diprosés transkripsi sabalikna, nalika mRNA ditranskripsi, primers oligo (dt) nu bisa ngabeungkeut polyA buntut husus dipaké pikeun transkripsi sabalikna, sedengkeun lncRNA jeung circRNA ngagunakeun hexamer acak (Random 6 mer) primers pikeun transkripsi sabalikna tina total RNA Pikeun miRNA, miRNA-spésifik beuheung-loop primers dipaké pikeun transkripsi sabalikna.Seueur perusahaan ayeuna parantos ngaluncurkeun kit tailing khusus.Pikeun padika stem-loop, métode tailing leuwih merenah, high-throughput, sarta réagen-hemat, tapi Pangaruh ngabedakeun miRNAs tina kulawarga anu sarua teu kudu jadi alus sakumaha metoda stem-loop.Unggal kit transkripsi ngabalikeun ngagaduhan syarat pikeun konsentrasi primer khusus gén (stem-loops).Rujukan internal anu digunakeun pikeun miRNA nyaéta U6.Dina prosés inversi batang-loop, tabung U6 kedah dibalikkeun sacara misah, sareng primer hareup sareng tonggong U6 kedah langsung ditambah.Duanana circRNA sareng lncRNA tiasa nganggo HKGs salaku rujukan internal.Dideteksi cDNA,
upami teu aya masalah sareng RNA, cDNA ogé kedah saé.Sanajan kitu, lamun kasampurnaan percobaan ieu neruskeun, éta pangalusna ngagunakeun gén rujukan internal (gén rujukan, RG) nu bisa ngabedakeun gDNA ti cd.Sacara umum, RG mangrupakeun gén housekeeping., HKG) ditémbongkeun saperti dina Gambar 10;Waktu éta, kuring nyieun protéin gudang kedele, sarta ngagunakeun actin7 ngandung introns salaku rujukan internal.Ukuran fragmen anu diamplifikasi tina primer ieu dina gDNA nyaéta 452bp, sareng upami cDNA dianggo salaku citakan, éta 142bp.Lajeng hasil tés kapanggih yén Bagian tina cDNA sabenerna kacemar ku gDNA, sarta eta oge ngabuktikeun yén teu aya masalah jeung hasil transkripsi sabalikna, sarta eta bisa dipaké salaku template pikeun PCR.Henteu aya gunana pikeun ngajalankeun éléktroforésis gél agarose langsung sareng cDNA, sareng éta mangrupikeun pita diffuse, anu henteu ngayakinkeun.

Gbr 10 deteksi cDNA

Nangtukeun kaayaan qPCRumumna euweuh masalah nurutkeun protokol kit, utamana dina hambalan nilai tm.Lamun sababaraha primers teu dirancang ogé salila desain primér, hasilna béda badag antara nilai tm jeung teoritis 60 ° C, eta disarankeun yén cDNA Saatos sampel dicampurkeun, ngajalankeun hiji PCR gradién kalawan primers, sarta coba ulah netepkeun suhu tanpa pita salaku nilai TM.

Analisis data

Métode ngolah PCR kuantitatif fluoresensi relatif konvensional dasarna dumasar kana 2-ΔΔCT.Témplat ngolah data.

Produk patali:

Real Time PCR Gampang^TM – Taqman

Real Time PCR Gampang^TM – SYBR Héjo I

RT Easy I (Master Premix pikeun sintésis cDNA untaian kahiji)

RT Easy II (Master Premix pikeun sintésis cDNA untaian munggaran pikeun qPCR)