PCR kuantitatif fluoresensi (ogé katelah TaqMan PCR, saterasna disebut FQ-PCR) nyaéta téknologi kuantitatif asam nukléat anyar anu dikembangkeun ku PE (Perkin Elmer) di Amérika Serikat dina taun 1995. Téknologi ieu dumasar kana PCR konvensional ku cara nambahkeun panyilidikan anu dilabélan fluoresensi.Dibandingkeun sareng PCR fléksibel, FQ-PCR ngagaduhan seueur kauntungan pikeun ngawujudkeun fungsi kuantitatifna.Artikel ieu boga maksud pikeun ngajelaskeun sakeudeung karakteristik, prinsip, métode, jeung aplikasi tina téhnologi.
1 Fitur
FQ-PCR teu ngan boga sensitipitas tinggi PCR biasa, tapi ogé kusabab aplikasi tina panyilidikan fluoresensi, éta bisa langsung ngadeteksi parobahan sinyal fluoresensi salila PCR Gedekeun ngaliwatan sistem konduksi photoelectric pikeun ménta hasil kuantitatif, nu overcomes loba shortcomings PCR konvensional, jadi eta oge boga spésifisitas tinggi téhnologi DNA hibridisasi jeung accuracy tinggi spéktroskopi hibridisasi.
Salaku conto, produk PCR umum kedah dititénan ku éléktroforésis gél agarose sareng pewarnaan étidium bromida ku sinar ultraviolét atanapi ku éléktroforésis gél polyacrylamide sareng pewarnaan pérak.Ieu mah ngan saukur merlukeun sababaraha instrumen, tapi ogé butuh waktu jeung usaha.Noda anu dianggo Ethidium bromide ngabahayakeun pikeun awak manusa, sareng prosedur ékspérimén anu rumit ieu masihan kasempetan pikeun polusi sareng positip palsu.Sanajan kitu, FQ-PCR ngan perlu muka tutup sakali salila sampel loading, sarta prosés saterusna sagemblengna ditutup-tube operasi, nu teu merlukeun PCR pos-processing, Ngahindarkeun loba drawbacks dina operasi PCR konvensional.Percobaan umumna ngagunakeun cycler termal ABI7100 PCR dikembangkeun ku parusahaan PE.
Alatna ngagaduhan ciri-ciri ieu: ① Aplikasi anu lega: Ieu tiasa dianggo pikeun kuantifikasi produk PCR DNA sareng RNA, panalungtikan éksprési gén, deteksi patogén, sareng optimasi kaayaan PCR.② Prinsip kuantitatif unik: Ngagunakeun panyilidikan fluoresensi dilabélan, jumlah fluoresensi bakal ngumpulkeun jeung siklus PCR sanggeus éksitasi laser, ku kituna pikeun ngahontal tujuan quantification.③ Efisiensi kerja tinggi: Diwangun-di 9600 PCR cycler termal, komputer dikawasa 1 nepi ka 2 jam pikeun ngarengsekeun amplifikasi jeung quantification 96 sampel otomatis tur synchronously.④ Teu perlu éléktroforésis gél: Teu perlu éncér jeung éléktroforésis sampel, ngan make usik husus pikeun ngadeteksi langsung dina tube réaksi.⑤No polusi dina pipa nu: The unik pinuh enclosed tube réaksi jeung sistem konduksi photoelectric diadopsi, jadi aya teu kudu salempang ngeunaan polusi.⑥Hasilna reproducible: rentang dinamis kuantitatif nepi ka lima ordo gedena.Ku alatan éta, saprak téhnologi ieu hasil dimekarkeun, éta geus hargana ku loba peneliti ilmiah sarta geus dilarapkeun dina loba widang.
2 Prinsip jeung métode
Prinsip gawé FQ-PCR nyaéta ngagunakeun aktivitas exonuclease 5′→3′ énzim Taq pikeun nambahkeun usik fluoresensi dilabélan kana sistem réaksi PCR.usik husus bisa hibridisasi jeung citakan DNA dikandung dina runtuyan primer.5′ tungtung usik dilabélan ku gén émisi fluoresensi FAM (6-carboxyfluorescein, puncak émisi fluoresensi dina 518nm), sarta tungtung 3′ dilabélan ku The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluoresensi puncak émisi 582 nu nyegah émisi 582 probegin of 582 probe tina émisi fluoresensi di phosphoning probegin of 582. usik ti keur diperpanjang salila amplifikasi PCR.Nalika usik tetep gembleng, grup quencher suppresses émisi fluoresensi tina grup emitting.Sakali grup emitting dipisahkeun tina grup quenching, inhibisi ieu diangkat, sarta dénsitas optik dina 518nm naek sarta dideteksi ku sistem deteksi fluoresensi. Dina fase renaturation, usik hybridizes jeung DNA template, sarta énzim Taq dina fase extension ngalir sapanjang template DNA jeung perluasan Primer.Nalika usik dipotong, pangaruh quenching dileupaskeun sareng sinyal fluoresensi dileupaskeun.Unggal waktos témplat disalin, usik dipotong, dipirig ku sékrési sinyal fluoresensi.Kusabab aya hubungan hiji-ka-hiji antara jumlah fluorophores dileupaskeun sarta jumlah produk PCR, téhnik ieu bisa dipaké pikeun akurat ngitung citakan.Instrumén ékspérimén umumna ngagunakeun siklus termal ABI7100 PCR anu dikembangkeun ku perusahaan PE, sareng siklus termal sanésna ogé tiasa dianggo.Upami sistem réaksi tipe réaksi ABI7700 dianggo pikeun ékspérimén, saatos réaksina réngsé, hasil kuantitatif tiasa langsung dipasihkeun ku analisa komputer.Upami anjeun nganggo siklus termal anu sanés, anjeun kedah nganggo detektor fluoresensi pikeun ngukur sinyal fluoresensi dina tabung réaksi dina waktos anu sami pikeun ngitung RQ +, RQ-, △RQ.RQ + ngagambarkeun babandingan inténsitas luminescence sahiji grup émisi fluoresensi tina tube sampel ka inténsitas luminescence sahiji grup quenching, RQ- ngagambarkeun babandingan dua dina tube kosong, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) ngagambarkeun jumlah robah sinyal fluoresensi salila PCR diala Hasilna kuantitatif sanggeus ngolah data.Kusabab ngenalkeun panyilidikan fluoresensi, spésifisitas percobaan ningkat sacara signifikan.Desain usik umumna kudu minuhan kaayaan di handap ieu: ①Panjang usik kudu ngeunaan 20-40 basa pikeun mastikeun spésifisitas mengikat.②Eusi basa GC antara 40% jeung 60% pikeun nyegah duplikasi runtuyan nukléotida tunggal.③ Hindarkeun hibridisasi atanapi tumpang tindih sareng primer.④ Stabilitas beungkeutan antara usik sareng citakan langkung ageung tibatan stabilitas beungkeutan antara primer sareng citakan, janten nilai Tm usik kedah sahenteuna 5 ° C langkung luhur tibatan nilai Tm primer.Salaku tambahan, konsentrasi usik, homologi antara usik sareng sekuen citakan, sareng jarak antara usik sareng primer sadayana gaduh pangaruh kana hasil ékspérimén.
Produk patali:
Cina Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Produsén jeung Supplier |Foregene (foreivd.com)
waktos pos: Oct-15-2021
