Percobaan RT-qPCR ngawengku ékstraksi RNA jeung assessment kualitas, transkripsi sabalikna na qPCR tilu léngkah, unggal hambalan ngabogaan loba precautions, urang bakal ngawanohkeun di jéntré handap.

Ⅰ.Penilaian kualitas RNA

Dina percobaan RT-qPCR, sanggeus parantosan ékstraksi RNA, kualitas RNA perlu dievaluasi, sarta percobaan nurutan-up ngan bisa dilaksanakeun sanggeus éta mumpuni.Métode évaluasi kalebet spéktrofotométer, Éléktroforésis gél Agilent, analisis Agilent 2100, diantarana spéktrofotométer anu paling sering dianggo sareng deteksi metode éléktroforésis gél agarose.Ieu kudu dicatet yén dua métode ieu perlu dipaké babarengan pikeun ngalengkepan deteksi jeung analisis konsentrasi RNA, purity jeung integritas, ku kituna pikeun mastikeun kualitas RNA.

Kit Isolasi RNA Patali: 

Sél Total RNA Isolasi Kit

RNA total anu dimurnikeun sareng kualitas luhur tiasa didapet tina sababaraha sél berbudaya dina 11 menit.

Sato Total RNA Isolasi Kit

Gancang sareng éfisién ékstrak RNA total anu murni sareng kualitas luhur tina sababaraha jaringan sato.

spéktrofotométer:

Spectrophotometer utamana dipaké pikeun nangtukeun konsentrasi sarta purity RNA, tapi teu bisa ngadeteksi integritas RNA jeung résidu génomik.Diantarana, A260/280 sareng A260/230 mangrupikeun parameter penting pikeun deteksi purity RNA, sareng purity RNA tiasa dideteksi dumasar kana turun naek nilaina:

1. 1.9< A260/280< 2.1, nunjukkeun yén purity RNA alus;A260/280<1.9, nunjukkeun yén meureun aya résidu protéin dina RNA;A260 / 280> 2.1, nunjukkeun kamungkinan degradasi parsial RNA, anu tiasa dikonfirmasi deui ku éléktroforésis gél agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, nunjukkeun yén purity RNA alus;A260/230< 2.0, nunjukkeun yén meureun aya résidu réagen organik dina RNA, sapertos fénol, étanol atanapi gula.

Éléktroforésis gél agarose:

Uji éléktroforésis gél agarose tiasa nganalisis integritas RNA, résidu génom sareng protéin, tapi teu tiasa akurat ngitung konsentrasi RNA atanapi ngadeteksi résidu réagen organik.Ambil contoh RNA eukariot:

1. RNA ieu subjected kana éléktroforésis gél agarose.Upami ngan ukur aya tilu pita tunggal 28sRNA, 18sRNA sareng 5.8sRNA dina peta gél, éta nunjukkeun yén RNA anu diekstrak éta utuh.Upami aya fenomena nyeret, éta nunjukkeun degradasi parsial RNA.

2. Lamun aya hiji pita caang tunggal antara liang lem jeung pita 28sRNA, meureun aya résidu DNA génomik.

3. Upami pita muncul dina liang lem, éta nunjukkeun yén meureun aya résidu protéin sareng zat makromolekul sanés.

Ⅱ. Transkripsi sabalikna

Sanggeus ékstraksi RNA réngsé, éta perlu dibalikkeun kana cDNA pikeun percobaan saterusna, jadi hambalan ngabalikeun penting.Reverse transcription bakal diwanohkeun tina pilihan reverse transcriptase sareng primer:

Pilihan reverse transcriptase:

Transkripase sabalikna has kalebet AMV RTase sareng MMLV RTase.RNase H tina AMV RTase boga aktivitas kuat, panjang sintésis pondok, jumlah sintésis low jeung stabilitas termal alus (42 ~ 55 ℃).Aktivitas RNase H MMLV RTase lemah, panjang sintésis panjang, jumlah sintésis luhur, sareng stabilitas termal goréng (37 ~ 42 ℃).

Kusabab énzim RNase H boga fungsi ngahinakeun citakan RNA, MMLV kalawan aktivitas RNase H lemah kudu preferentially dipilih salila transkripsi sabalikna, sarta sanggeus rékayasa genetik engké, stabilitas termal MMLV geus ngahontal kabisat kualitatif.Nyandak ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV pikeun transkripsi sabalikna) sabagé conto, éta mangrupa transcriptase sabalikna anyar dinyatakeun dina baktéri E. coli direkayasa ngagunakeun téhnologi rekombinasi genetik.Éta mangrupikeun polimérase DNA rékombinan anu nyintésis untaian DNA pelengkap tina RNA untaian tunggal, DNA, atanapi RNA: hibrida DNA.Éta henteu gaduh kagiatan RNase H, stabilitas anu kuat, pangirut RNA anu kuat, sareng sensitipitas deteksi anu luhur.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV pikeun transkripsi sabalikna)

Pilihan Primer:

Umumna primer RT digolongkeun kana tilu kategori: oligo dT, primer acak, jeung primer husus gén.Pilih primer anu cocog pikeun dianggo dumasar kana sarat ékspérimén anu béda.

1. Lamun citakan asalna eukariot jeung cDNA ahir dipaké pikeun amplifikasi PCR rutin, disarankeun Oligo (dT);Lamun percobaan saterusna ngan dipaké pikeun qPCR, Oligo (dT) disarankeun pikeun dicampurkeun jeung primers acak pikeun ngaronjatkeun efisiensi transkripsi sabalikna.

2. Lamun citakan ti prokariot, Primer Acak atawa primer husus gén kudu dipilih pikeun transkripsi sabalikna.

Ⅲ.qPCR

Kuantifikasi fluoresensi utamana dijelaskeun tina pilihan metode kuantitatif, prinsip desain primer, pilihan ROX, konfigurasi sistem réaksi sareng setting kaayaan réaksi, jsb.

Pamilihan métode kuantitatif:

Métode kuantitatif dibagi jadi métode kuantitatif rélatif jeung métode kuantitatif mutlak.Kuantifikasi rélatif bisa dipaké pikeun ngadeteksi pangaruh métode perlakuan nu tangtu dina éksprési gén, ngadeteksi bédana éksprési gén dina waktu béda jeung ngabandingkeun bédana éksprési gén dina jaringan béda.Kuantifikasi mutlak tiasa ngadeteksi jumlah asam nukléat dina virus sareng saterasna.Nalika ngalakukeun ékspérimén, urang kedah milih metode kuantitatif anu pas dumasar kana ékspérimén urang sorangan.

Prinsip desain primér:

Desain primér pikeun qPCR langsung patali jeung efisiensi amplifikasi jeung spésifisitas produk.Ku alatan éta, leres ngarancang primers alus nyaéta léngkah munggaran dina qPCR suksés.Dina desain primer, prinsip-prinsip ieu kedah diperhatoskeun nalika nyumponan prinsip desain primer konvensional:

1. Panjang fragmen target dikawasa antara 100 sareng 300 bp;

2. Desain cross-exon pikeun nyingkahan pangaruh DNA génomik;

3. Primer dirancang kudu diuji pikeun efisiensi amplifikasi, sarta ngan lamun efisiensi amplifikasi ngahontal standar (90-110%), aranjeunna bisa dipaké pikeun percobaan kuantitatif;

4. konsentrasi Primer biasana dioptimalkeun antara 0.1uM na 1.0uM.

Pilihan tinaROX:

Dina prosés réaksi kuantitatif, ROX tiasa nyaluyukeun bédana jalur optik, kasalahan pipetting atanapi bédana volume disababkeun ku évaporasi sareng kondensasi sacara seragam, ningkatkeun kaulangan hasil.Nanging, kedah diperhatoskeun yén pilihan ROX aya hubunganana sareng alat.Lamun instrumen qPCR boga fungsi otomatis ngabenerkeun bédana antara liang, teu perlu nambahkeun ROX;disebutkeun, eta perlu nambahkeun koreksi ROX.Mitra leutik dina meuli réagen kudu nurutkeun instrumen dipaké pikeun milih ROX bener, ulah kasalahan engké.

Persiapan sistem réaksi:

Jilid réaksi 20ul sareng 50ul langkung dipikaresep.Hal-hal di handap ieu kedah diperhatoskeun nalika sistem dirumuskeun:

1. Sistim réaksi perlu disiapkeun ku ventilasi dina workbench ultra-bersih, ddH anyar₂O dipaké pikeun tiap percobaan;

2. Unggal percobaan perlu nyiapkeun NTC pikeun pariksa naha aya polusi dina sistem, sarta unggal pasangan primers perlu ngalakukeun NTC nalika Nyiapkeun sistem;

3. Pikeun ngadeteksi naha aya résidu gDNA dina citakan RNA, NRT bisa disiapkeun pikeun tiap sampel pikeun deteksi;

4. Nalika Nyiapkeun sistem, eta disarankeun pikeun ngalakukeun sahenteuna 3 repeats teknis pikeun hiji sampel;

5. Nalika citakan cDNA, disarankeun pikeun éncér 5-10 kali pikeun ngurangan éfék inhibisi sistem transkripsi sabalikna dina percobaan qPCR.Éta hadé ngajajah kuantitas template ku gradién, ku kituna nilai CT ragrag antara 20-30;

6. Nangtukeun jumlah réaksi nu diperlukeun, nambahan ku 5-10% dumasar kana jumlah réaksi, sarta ngitung jumlah konfigurasi volume;

7, sistem disiapkeun ngagunakeun prinsip premix, Pergaulan sanggeus centrifugation sarta mastikeun euweuh gelembung;

8, Sajauh mungkin pikeun milih consumables ngarojong.

Pakait RT-qPCR Kit