Perlu dipikanyaho yén dina dogma sentral, RNA mangrupikeun mediator transkripsi antara DNA sareng ekspresi protéin.Dibandingkeun sareng deteksi DNA, deteksi RNA tiasa langkung obyektif ngagambarkeun ekspresi gen dina organisme.Percobaan ngalibetkeun RNA ngawengku: qRT-PCR, RNA-Seq, sarta deteksi gén fusi, jsb Dumasar kana karakteristik RNA sorangan (cingcin gula RNA boga hiji gugus hidroksil bébas leuwih ti cingcin gula DNA), gandeng ku angka nu gede ngarupakeun RNases di lingkungan, RNA leuwih teu stabil sarta gampang didegradasi ti DNA.Sampah asup, sampah kaluar, lamun kualitas RNA teu alus, mangka hasil eksperimen kudu unsatisfactory, husus manifested salaku data akurat atawa bisa ulang goréng.Ku alatan éta, perhatian leuwih kudu dibayar ka ngolah RNA, sarta link kontrol kualitas ogé leuwih penting pikeun mastikeun precision jeung akurasi data eksperimen saterusna.

Pikeun kadali kualitas RNA, umumna aya metodeu anu biasa dianggo:

• Séktrofotometri
• Éléktroforésis gél agarose
• Agilent Bioanalyzer
• PCR kuantitatif fluoresensi sacara real-time
• Metoda pewarna fluoresensi Qubit

01 Spéktrofotometri

RNA boga beungkeut ganda konjugasi sarta boga puncak serapan dina panjang gelombang 260nm.Numutkeun hukum Lambert-Beer, urang tiasa ngitung konsentrasi RNA tina puncak nyerep dina 260nm.Salaku tambahan, urang ogé tiasa ngitung kamurnian RNA dumasar kana rasio puncak nyerep 260nm, 280nm sareng 230nm.280nm sareng 230nm mangrupikeun puncak nyerep protéin sareng molekul leutik, masing-masing.Babandingan A260 / A280 sareng A260 / A230 tina kamurnian RNA anu mumpuni kedah langkung ageung tibatan 2. Upami kirang ti 2, éta hartosna aya kontaminasi protéin atanapi molekul leutik dina sampel RNA sareng kedah dimurnikeun deui.Sumber kontaminasi bakal mangaruhan percobaan hilir, sapertos ngahambat efisiensi amplifikasi réaksi PCR, nyababkeun hasil kuantitatif anu teu akurat.Kamurnian RNA boga pangaruh gede dina hasil saterusna, jadi spéktrofotometri umumna mangrupa link kontrol kualitas indispensable dina hambalan kahiji dina percobaan asam nukléat.

Gambar 1. Spéktrum Nyerep RNA/DNA has

02 Éléktroforésis gél agarose

Salian kamurnian, integritas RNA ogé salah sahiji indikator penting pikeun nangtoskeun kualitas RNA.Degradasi RNA bakal ngakibatkeun sajumlah badag fragmen pondok dina sampel, jadi jumlah fragmen RNA nu bisa éféktif dideteksi jeung katutupan ku runtuyan rujukan bakal ngurangan.Integritas RNA bisa dipariksa ku éléktroforésis tina total RNA dina gél agarose 1%.Metoda ieu tiasa ngonpigurasikeun gél sorangan, atanapi nganggo Sistem E-Gel™ prefabricated pikeun nguji integritas.Langkung ti 80% tina total RNA nyaéta RNA ribosom, anu seuseueurna diwangun ku 28S sareng 18S rRNA (dina sistem mamalia).RNA kualitas alus bakal nembongkeun dua bar caang atra, nu 28S na 18S bar caang, masing-masing dina 5 Kb jeung 2 Kb, sarta rasio bakal condong jadi deukeut 2:1.Lamun dina kaayaan diffuse, hartina sampel RNA mungkin geus didegradasi, sarta eta disarankeun pikeun ngagunakeun métode dijelaskeun engké pikeun nguji salajengna kualitas RNA.

Gambar 2. Perbandingan degradasi (jalur 2) sareng RNA utuh (jalur 3) dina éléktroforésis gél agarose

03 Agilent Bioanalyzer

Salian metode éléktroforésis gél agarose anu dijelaskeun di luhur, anu tiasa ngabantosan urang ngaidentipikasi integritas RNA sacara sederhana sareng gancang, urang ogé tiasa nganggo bioanalyzer Agilent pikeun nangtukeun integritas RNA.Ngagunakeun kombinasi microfluidics, éléktroforésis kapilér, sarta fluoresensi pikeun assess konsentrasi RNA jeung integritas.Kalayan ngagunakeun algoritma anu diwangun pikeun nganalisis profil sampel RNA, bioanalyzer Agilent tiasa ngitung nilai integritas RNA rujukan, Nomer Integritas RNA (saterusna disebut RIN) [1].Langkung ageung nilai RIN, langkung luhur integritas RNA (1 parah pisan, 10 mangrupikeun panglengkep).Sababaraha percobaan ngalibetkeun RNA nyarankeun ngagunakeun RIN salaku parameter pikeun assessment kualitas.Nyandak percobaan sequencing throughput tinggi (saterusna disebut NGS) salaku conto, tungtunan Oncomine ™ Human Immune Repertoire, anu digunakeun pikeun ngadeteksi sél B sareng reséptor antigén sél T dina séri panel Oncomine Thermo Fisher, nunjukkeun yén sampel kalayan nilai RIN langkung ageung ti 4, Bacaan sareng klon anu langkung efektif tiasa diukur 3 (Gambar).Aya rentang dianjurkeun béda pikeun panels béda, sarta mindeng hiji RIN luhur bisa mawa data leuwih éféktif.

Gambar 3, dina percobaan Oncomine ™ Human Immune Repertoire, sampel kalawan RIN leuwih gede ti 4 bisa ngadeteksi maca leuwih éféktif jeung clones sél T.【2】

Sanajan kitu, nilai RIN ogé boga sababaraha watesan.Sanaos RIN gaduh korelasi anu luhur sareng kualitas data ékspérimén NGS, éta henteu cocog pikeun conto FFPE.Sampel FFPE parantos diolah sacara kimia pikeun waktos anu lami, sareng RNA anu sasari umumna ngagaduhan nilai RIN anu kawilang rendah.Nanging, ieu sanés hartosna yén data ékspérimén anu épéktip kedah henteu nyugemakeun.Pikeun akurat meunteun kualitas sampel FFPE, urang kedah nganggo ukuran lian ti RIN.Salian RIN, Agilent bioanalyzer ogé bisa ngitung nilai DV200 salaku parameter evaluasi kualitas RNA.DV200 mangrupakeun parameter nu ngitung proporsi fragmen leuwih badag batan 200 bp dina sampel RNA.DV200 mangrupikeun indikator kualitas sampel FFPE anu langkung saé tibatan RIN.Pikeun RNA anu diekstrak ku FFPE, éta gaduh korelasi anu luhur pisan sareng jumlah gén anu tiasa dideteksi sacara efektif sareng karagaman gén [3].Sanaos DV200 tiasa nyéépkeun kakurangan dina deteksi kualitas FFPE, bioanalyzer Agilent masih teu tiasa sacara komprehensif nganalisa masalah kualitas dina conto RNA, kalebet naha aya sambetan dina conto.Inhibitor sorangan tiasa mangaruhan efisiensi amplifikasi percobaan hilir sareng ngirangan jumlah data mangpaat.Pikeun terang naha aya inhibitor dina sampel, urang tiasa ngadopsi metode PCR kuantitatif fluoresensi sacara real-time anu dijelaskeun salajengna.

04 PCR kuantitatif fluoresensi sacara real-time

Métode PCR kuantitatif fluoresensi sacara real-time henteu ngan ukur tiasa ngadeteksi sambetan dina sampel, tapi ogé akurat ngagambarkeun kualitas RNA dina sampel FFPE.Dibandingkeun sareng analisa biologis Agilent, instrumen kuantitatif fluoresensi sacara real-time langkung populer di laboratorium biologis utama kusabab aplikasina anu langkung lega.Pikeun nguji kualitas sampel RNA, urang ngan kudu meuli atawa nyiapkeun panyilidikan primer pikeun gén rujukan internal, kayaning GUSB (Cat no. Hs00939627).Ku ngagunakeun susunan primers, panyilidikan jeung standar ieu (total RNA tina konsentrasi dipikawanoh) pikeun ngalakonan percobaan kuantitatif mutlak, konsentrasi fragmén RNA éféktif bisa diitung salaku standar evaluasi kualitas RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) pikeun pondok).Dina tés NGS, urang mendakan yén FRQ tina conto RNA ngagaduhan korelasi anu luhur pisan sareng volume data anu efektif.Pikeun sakabéh sampel leuwih gede ti 0.2ng/uL FRQ, sahenteuna 70% tina bacaan bisa éféktif nutupan runtuyan rujukan (Gambar 4).

Gambar 4, nilai FRQ nu dideteksi ku métode kuantitatif fluoresensi boga korelasi kacida luhurna (R2> 0.9) jeung data éféktif diala dina percobaan NGS.Garis beureum nyaéta nilai FRQ sarua jeung 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Salian tiasa dianggo pikeun conto FFPE, metode PCR kuantitatif sacara real-time ogé tiasa sacara efektif ngawas sambetan dina conto.Urang tiasa nambihan sampel pikeun dideteksi kana sistem réaksi kalayan Kontrol Positif Internal (IPC) sareng Assay na, teras ngalakukeun kuantifikasi fluoresensi pikeun kéngingkeun nilai Ct.Lamun nilai Ct lags balik nilai Ct dina réaksi no-sampel, éta nunjukkeun yén inhibitor aya dina sampel sarta ngahambat efisiensi amplifikasi dina réaksi.

05 Qubit metode pewarna fluoresensi

Qubit Fluorometer mangrupikeun alat leutik anu paling sering dianggo pikeun konsentrasi asam nukléat sareng deteksi purity, anu gampang dioperasikeun sareng aya di ampir unggal laboratorium biologi molekular.Éta akurat ngitung konsentrasi asam nukléat ku cara ngadeteksi sareng pewarna fluoresensi anu mengikat asam nukléat (réagen deteksi Qubit).Qubit gaduh sensitipitas sareng spésifisitas anu luhur, sareng tiasa sacara akurat ngitung RNA dugi ka konsentrasi pg / µL.Salian kamampuan anu terkenal pikeun ngitung konsentrasi asam nukléat sacara akurat, modél énggal panganyarna Thermo Fisher, Qubit 4.0, ogé tiasa ngadeteksi integritas RNA.Sistem deteksi RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) ngadeteksi integritas RNA ku sakaligus ngadeteksi dua pewarna fluoresensi khusus.Dua pewarna fluoresensi ieu tiasa ngabeungkeut fragmen ageung sareng fragmen leutik RNA, masing-masing.Dua pewarna fluoresensi ieu nunjukkeun proporsi fragmen ageung RNA dina sampel, sareng tina ieu nilai IQ (Integritas sareng Kualitas) anu ngagambarkeun kualitas RNA tiasa diitung.Nilai IQ lumaku pikeun sampel FFPE jeung non-FFPE, sarta boga pangaruh hébat kana kualitas sequencing saterusna.Nyandak ékspérimén NGS sabagé conto, dina ékspérimén tés RNA-Seq anu dilakukeun dina platform Ion torrent™, sabagéan ageung sampel kalayan nilai IQ langkung ageung ti 4 ngagaduhan sahenteuna 50% bacaan anu efektif (Gambar 5).Dibandingkeun jeung métode deteksi luhur-disebutkeun, Qubit IQ Assay henteu ngan leuwih merenah pikeun beroperasi sarta nyokot kirang waktos (dina lima menit), tapi ogé boga korelasi hébat antara nilai IQ parameter diukur jeung kualitas data percobaan hilir.

Gambar 5, aya korelasi hébat antara nilai Qubit RNA IQ jeung maca dipetakeun RNA-Seq.【5】

Ngaliwatan bubuka di luhur, kuring yakin yén dulur boga pamahaman cukup ngeunaan métode kontrol kualitas RNA béda.Dina prakték, anjeun tiasa milihmétode nu saluyu jeung tipe sampel sarta instrumen aya.Ngan ku ngadalikeun kualitas RNA ogé urang bisa nyingkahan gagalna percobaan saterusna disababkeun ku kualitas sampel goréng, sahingga ngahemat waktu adi, tanaga jeung ongkos.

Produk rujukan:

Sato Total RNA Isolasi Kit

Sél Total RNA Isolasi Kit

rujukan

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: nomer integritas RNA pikeun nangtukeun nilai integritas kana pangukuran RNA.BMC Molekul Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Panungtun Pamaké Oncomine Human Immune Repertoire (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Métrik Kualitas Ditingkatkeun pikeun Meunteun RNA Diturunkeun Tina Arsip Sampel Tissue Parafin-Fixed Parafin, Élmu Toksikologi, Jilid 170, 3 Agustus, Edisi 3, Agustus 3https://doi.org/10.1093/toxsci/