Sterilisasi tip pipette sareng tabung EP, jsb.

1. Nyiapkeun 0,1% (saperseribu) DEPC (zat kacida toksik) kalawan cai deionized, make eta taliti dina tiung fume, sarta nyimpen eta dina 4 ° C jauh ti lampu;

Cai DEPC nyaéta cai murni anu dirawat kalayan DEPC sareng disterilisasi ku suhu luhur sareng tekanan tinggi.Diuji bébas tina RNase, DNase sareng protéinase.

2. Nempatkeun tip pipette na tube ep kana 0,1% DEPC, sarta mastikeun yén tip pipette na tube ep nu ngeusi 0,1% DEP.

3. Ngajaga tina cahaya, hayu nangtung, sapeuting (12-24h)

4. Kotak anu ngandung tip sareng tabung ep henteu kedah direndam dina DEPC.Saatos miceun kasarna cai DEPC dina tip atanapi tabung EP, bungkus sareng bungkusna.

5. 121 darajat Celsius, 30 mnt

6. 180 darajat Celsius, garing sababaraha jam (minimal 3 jam)

Catetan: a.Anggo sarung tangan lateks sareng masker nalika nanganan DEPC!b, atanapi tanpa sterilisasi DEPC, 130 ℃, 90min autoclave (seueur laboratorium sterilisasi suhu luhur dua kali)

Pertimbangan ékstraksi RNA

Dua fenomena utama gagalna isolasi RNA jaringan

Degradasi RNA sareng résidu najis dina jaringan,ngeunaan degradasi, hayu urang tingali heula naha RNA sasari tina sél kultur teu gampang didegradasi.Réagen ékstraksi RNA anu aya sadayana ngandung komponén anu gancang ngahambat RNase.Nambahkeun lysate kana sél berbudaya, sarta ngan gaul eta, sakabeh sél bisa tuntas dicampurkeun jeung lysate, sarta sél sagemblengna lysed.Saatos sél dilisiskeun, bahan aktif dina lisat langsung ngahambat RNase intrasélular, ku kituna RNA tetep utuh.Maksudna, sabab sél berbudaya gampang sareng pinuh dikontak sareng lisat, RNAna henteu gampang didegradasi;di sisi séjén, RNA dina jaringan gampang didegradasi sabab sél dina jaringan teu gampang pikeun gancang ngahubungan lysate nu.alatan kontak cukup.Janten,Anggap aya cara pikeun ngarobah jaringan kana sél tunggal bari ngahambat aktivitas RNA, masalah degradasi bisa direngsekeun lengkep.

Panggilingan nitrogén cair mangrupikeun metode anu paling efektif.Sanajan kitu, metoda panggilingan nitrogén cair pisan troublesome, utamana lamun jumlah sampel badag.Ieu nyababkeun hal anu pangsaéna: homogenizer.ThehomogenizerMetoda henteu nganggap patarosan kumaha kagiatan RNase dihambat sateuacan sél dihubungi sareng lysate, tapi ngadoakeun yén laju gangguan jaringan langkung gancang tibatan laju dimana RNase intrasélular ngadegradasi RN.

Pangaruh homogenizer listrik langkung saé,jeung pangaruh kaca homogenizer goréng, tapi sacara umum, métode homogenizer teu bisa nyegah fenomena degradasi.Ku alatan éta, lamun ékstraksi ieu didegradasi, nu homogenizer listrik aslina kudu dipaké pikeun grinding kalawan nitrogén cair;homogenizer kaca aslina kudu dirobah jadi homogenizer listrik atawa langsung giling kalawan nitrogén cair.Masalahna ampir 100% tiasa dilaksanakeun.meunang ngumbar.

Masalah résidu najis mangaruhan percobaan saterusna boga sabab leuwih rupa-rupa ti degradasi, sarta solusi anu correspondingly béda.Kasimpulanana,lamun aya degradasi atawa rereged residual dina jaringan, métode ékstraksi / réagen pikeun bahan ékspérimén husus kudu dioptimalkeun.Anjeun teu kudu make sampel berharga Anjeun pikeun optimasi: Anjeun bisa meuli sababaraha sato leutik kawas lauk/hayam ti pasar, nyokot bagian pakait tina bahan pikeun ékstraksi RNA, jeung bagian séjén pikeun ékstraksi protéin – grind jeung sungut, burih jeung nimba peujit.

Target RNA tina RNA sasari dipaké pikeun percobaan nurutan-up béda, sarta syarat kualitas na béda

Konstruksi perpustakaan cDNA merlukeun integritas RNA tanpa résidu inhibitor réaksi énzim;Kalér merlukeun integritas RNA luhur jeung sarat handap pikeun résidu inhibitor réaksi énzim;RT-PCR henteu meryogikeun integritas RNA anu luhur teuing,tapi ngahambat réaksi énzim.Syarat résidu anu ketat.Input nangtukeun kaluaran;unggal waktos tujuanana pikeun ménta RNA purity pangluhurna, éta bakal ngarugikeun jalma jeung duit.

Koléksi / Panyimpenan Sampel

Faktor Pangaruh Degradasi Saatos sampel ninggalkeun awak hirup / atawa lingkungan tumuwuh aslina, énzim endogenous dina sampel bakal mimiti nguraikeun RNA,sarta laju degradasi patali jeung eusi énzim endogenous jeung suhu.Sacara tradisional, aya ngan dua cara pikeun sakabéhna ngahambat aktivitas énzim endogenous: nambahkeun lysate geuwat sarta homogenize tuntas jeung gancang;potong buah leutik jeung geura freeze dina nitrogén cair.Duanana pendekatan merlukeun operasi gancang.Panungtungan ieu cocog pikeun sakabéh sampel, sedengkeun urut ngan cocog pikeun jaringan kalawan eusi low sél jeung énzim endogenous sarta gampang homogenize.Sacara husus, jaringan tutuwuhan, ati, timus, pankréas, limpa, otak, lemak, jaringan otot, jeung sajabana anu pangalusna beku kalawan nitrogén cair saméméh lajengkeun.

Fragméntasi jeung homogenisasi sampel

Faktor Pangaruh Degradasi jeung Ngahasilkeun Fragméntasi Sampel nyaetapikeun homogenisasi lengkep, anu kanggo pelepasan lengkep sareng lengkep RNA.Sél bisa langsung homogenized tanpa pegat.Tisu tiasa dihomogenisasi ngan saatos rusak.Ragi sareng baktéri kedah dirobih sareng énzim anu cocog sateuacan aranjeunna tiasa homogen.Jaringan kalawan eusi énzim endogenous handap sarta homogenization gampang bisa ditumbuk jeung homogenized dina hiji waktu di lysate ku homogenizer a;jaringan tutuwuhan, ati, timus, pankréas, limpa, otak, lemak, jaringan otot jeung sampel lianna, Éta boh tinggi di énzim endogenous atanapi henteu gampang homogenized,jadi gangguan jaringan jeung homogenization kudu dipigawé misah.Metodeu fragméntasi anu paling dipercaya sareng paling produktif nyaéta ngagiling sareng nitrogén cair, sareng metode homogenisasi anu paling dipercaya nyaéta ngagunakeun homogenizer listrik.Catetan husus ngeunaan panggilingan kalawan nitrogén cair: sampel teu kudu thawed salila sakabéh prosés panggilingan, sabab énzim endogenous leuwih gampang fungsina lamun beku.

Pilihan lysate

Mangaruhan genah operasi sarta faktor residual najis endogenous Solusi lisis ilahar dipaké ampir bisa ngahambat aktivitas RNase.Ku alatan éta, titik konci milih solusi lysis nyaeta mertimbangkeun dina kombinasi jeung métode purifikasi.Aya hiji pengecualian:sampel kalawan eusi énzim endogenous tinggi dianjurkeun ngagunakeun lysate ngandung fénol pikeun ngaronjatkeun kamampuh nganonaktipkeun énzim endogenous.

Pilihan metode purifikasi

Faktor nu mangaruhan sésa pangotor endogenous, laju ékstraksi Pikeun sampel bersih kayaning sél, hasil nyugemakeun bisa diala ku ampir sagala métode purifikasi di leungeun.Tapi pikeun seueur conto sanés, khususna anu ngagaduhan tingkat najis anu luhur sapertos pepelakan, ati, baktéri, sareng sajabana, milih metode purifikasi anu cocog penting pisan.Métode purifikasi centrifugal kolom boga laju ékstraksi gancang tur éféktif bisa miceun pangotor nu mangaruhan réaksi énzimatik saterusna RNA, tapi mahal (Foregene tiasa nawiskeun kit ongkos-éféktif, leuwih rinci klik.Ieuh);ngagunakeun métode purifikasi ekonomis jeung klasik, kayaning présipitasi LiCl, ogé bisa ménta hasil nyugemakeun, tapi waktu operasi panjang..

"Tilu Disiplin sareng Dalapan Perhatosan" pikeun Ekstraksi RNA

Disiplin 1:Nunda hiji tungtung kontaminasi énzim exogenous.

Catetan 1:Anggo masker sareng sarung tangan.

Catetan 2:Tabung centrifuge, hulu tip, rod pipette, tanghi éléktroforésis, jeung bangku ékspérimén aub dina percobaan kudu tuntas disposed tina.

Catetan 3:Réagen/solusi anu aub dina percobaan, khususna cai, kedah bebas RNase.

Disiplin 2:Blok kagiatan énzim endogen

Catetan 4:Pilih metode homogenisasi anu pas.

Catetan 5:Milih hiji lysate luyu.

Catetan 6:Kontrol jumlah mimiti sampel.

Disiplin 3:Jelaskeun tujuan ékstraksi anjeun

Catetan 7:Kalayan sagala sistem lysate ngadeukeutan jumlah awal maksimum sampel, laju kasuksésan ékstraksi pakait sharply.

Catetan 8:Hiji-hijina kriteria ékonomi pikeun ékstraksi RNA suksés nyaéta kasuksésan dina percobaan saterusna, teu ngahasilkeun.

Top 10 Sumber Kontaminasi RNase

1. Ramo mangrupakeun sumber munggaran énzim exogenous, jadi sarung kudu dipaké sarta diganti remen.Sajaba ti éta, masker ogé kudu dipaké, sabab engapan ogé mangrupa sumber penting énzim.Kauntungan tambahan tina ngagem topéng sarung tangan nyaéta pikeun ngajagaan ékspérimén.

2. Tip pipette, tabung centrifuge, pipettes - RNase teu bisa inactivated ku sterilization nyalira, jadi tips pipette na tabung centrifuge kudu dirawat kalayan DEPC, sanajan aranjeunna ditandaan salaku DEPC dirawat.Hadé pisan mun éta ngagunakeun pipette husus-Tujuan, ngusap eta kalawan 75% bal kapas alkohol saméméh pamakéan, utamana rod;Sajaba ti éta, pastikeun teu make remover sirah.

3. Cai / panyangga kedah bébas tina kontaminasi RNase.

4. Sahenteuna tabel test kudu musnah beresih jeung 75% bal katun alkohol.

5.Endogenous RNase Sadaya jaringan ngandung énzim endogenous, jadi katirisan gancang jaringan jeung nitrogén cair nyaéta cara pangalusna pikeun ngurangan degradasi.Métode neundeun / grinding nitrogén cair memang teu merenah, tapi éta hiji-hijina jalan pikeun jaringan kalawan tingkat luhur énzim endogenous.

6. Sampel RNA Produk ékstraksi RNA bisa ngandung jejak kontaminasi RNase.

7. Ekstraksi Plasmid Ekstraksi Plasmid sering ngagunakeun Rnase pikeun nguraikeun RNA, sareng Rnase residual kedah dicerna sareng Proteinase K sareng diekstrak ku PCI.

8. Panyimpenan RNA Malah lamun disimpen dina suhu low, jumlah renik RNase bakal ngabalukarkeun degradasi RNA.Solusi anu pangsaéna pikeun ngawétkeun RNA jangka panjang nyaéta gantung uyah/alkohol, sabab alkohol ngahambat sadaya kagiatan énzimatik dina suhu anu handap.

9. Nalika kation (Ca, Mg) ngandung ion-ion ieu, pemanasan dina suhu 80C salila 5 menit bakal ngabalukarkeun RNA dibeulah, jadi lamun RNA perlu dipanaskeun, solusi pangawetan perlu ngandung agén chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6,4).

10. Énzim dipaké dina percobaan saterusna bisa kacemar ku RNase.

10 Tips pikeun RNA ékstraksi

1: Gancang nyegah aktivitas RNase.Sampel gancang beku saatos ngumpulkeun, sareng RNase dinonaktipkeun ku operasi gancang nalika lisis.

2: Pilih metode ékstraksi anu pas pikeun jaringan anu ngandung ribozim anu luhur, sareng jaringan adiposa langkung saé ngagunakeun metode anu ngandung fénol.

3: Kualitas prediksi merlukeun Northern, konstruksi perpustakaan cDNA merlukeun integritas tinggi, sarta RT-PCR na RPA (assay panyalindungan Ribonuclease) teu merlukeun integritas tinggi.RT-PCR merlukeun purity tinggi (résidu inhibitor énzim).

4: homogenization teleb mangrupakeun konci pikeun ngaronjatkeun ngahasilkeun sarta ngurangan degradasi.

5: Pariksa integritas deteksi éléktroforésis RNA, 28S: 18S = 2: 1 mangrupakeun tanda lengkep, 1: 1 oge bisa ditarima keur paling percobaan.

6: Lengser DNA pikeun RT-PCR, analisis Asép Sunandar Sunarya Hadé pisan mun éta ngagunakeun Dnase I ngaleupaskeun DNA.

7: Ngurangan kontaminasi énzim exogenous - énzim teu bisa diimpor ti luar.

8: Nalika konsentrasi asam nukléat konsentrasi-rendah, réagen ko-présipitasi kedah ditambihan.Tapi pikeun nyegah ko-précipitant ngandung énzim jeung kontaminasi DNA.

9: Tuntas ngaleyurkeun RNA, upami diperlukeun, panas dina 65C salila 5 menit.

métode gudang cocog

Éta tiasa disimpen dina -20C kanggo waktos anu pondok, sareng dina -80C kanggo waktos anu lami.Léngkah munggaran pikeun ningkatkeun hasil RNA nyaéta sadar yén eusi RNA tina sampel anu béda-béda pisan.Kelimpahan tinggi (2-4ug/mg) kayaning ati, pankréas, jantung, kaayaanana sedeng (0.05-2ug/mg) kayaning otak, embrio, ginjal, paru, timus, ovarium, kaayaanana low (<0.05ug/mg) mg) kayaning kandung kemih, tulang, lemak.

1: Lyse sél pikeun ngaleupaskeun RN - lamun RNA teu dileupaskeun, ngahasilkeun bakal ngurangan.Homogénisasi listrik tiasa dianggo langkung saé tibatan metode homogenisasi sanés, tapi ogé kedah digabungkeun sareng metode sanés, sapertos mashing nitrogén cair, nyerna énzimatik (Lysozyme / Lyticase)

2: Optimasi sahiji metodeu ékstraksi.Masalah anu paling ageung sareng metode dumasar fénol nyaéta stratifikasi teu lengkep sareng leungitna RNA parsial (supernatan teu tiasa dileungitkeun lengkep).Stratifikasi henteu lengkep disababkeun ku asam nukléat sareng eusi protéin anu luhur, anu tiasa direngsekeun ku cara ningkatkeun jumlah lisat anu dianggo atanapi ngirangan jumlah sampel.Hiji hambalan ékstraksi kloroform ditambahkeun kana jaringan adiposa.Leungitna RNA bisa dikurangan ku back-pumping atawa ku nyoplokkeun lapisan organik dituturkeun ku sentrifugasi.Masalah pangbadagna kalayan metode dumasar centrifugation kolom téh kaleuwihan sampel.

Tip ékstraksi Palasik

1. Purifikasi phenol: Tambahkeun volume sarua 1: 1 Phenol / Kloroform jeung mix vigorously pikeun 1-2 menit.Centrifuge dina speed tinggi pikeun 2 menit.Taliti miceun supernatant (80-90%).Pernah nepi ka lapisan tengah.Hiji volume sarua leyuran réaksi bisa ditambahkeun kana Phenol / Kloroform jeung supernatant dihapus.Dua supernatan bisa dicampur babarengan pikeun présipitasi asam nukléat pikeun ngaronjatkeun ngahasilkeun.Ulah jadi lemes teuing nalika nyampur, sarta ulah coba miceun kabeh supernatant.

2. Ngumbah jeung 70-80% étanol: Salila ngumbah, asam nukléat kudu ditunda pikeun mastikeun yén uyah sésa dikumbah jauh.Dina waktu nu sarua, langsung saatos tuang kaluar étanol nu, centrifuge dina speed tinggi pikeun sababaraha detik, lajeng miceun étanol residual kalawan pipette a.Leyur sanggeus nangtung dina suhu kamar pikeun 5-10 menit.

11. Ekstraksi organisasi husus

1. Jaringan fibrosa: Konci pikeun ékstraksi RNA tina jaringan fibrosa sapertos jantung / otot rangka nyaéta pikeun ngaganggu lengkep jaringan.Jaringan ieu gaduh dénsitas sél anu rendah, janten jumlah RNA per unit beurat jaringan rendah, sareng langkung saé ngagunakeun jumlah awal anu mungkin.Pastikeun pikeun grind jaringan tuntas dina kaayaan katirisan.

2. Jaringan anu eusina protéin/lemak tinggi: kandungan lemak otak/sayur luhur.Saatos ékstraksi PCI, supernatant ngandung floccules bodas.Supernatant kudu diekstrak deui ku kloroform.

3. Jaringan nu ngandung asam nukléat/ribozim nu luhur: limpa/timus nu ngandung asam nukléat jeung ribozim nu luhur.Grinding jaringan dina kaayaan katirisan dituturkeun ku homogenisasi gancang bisa éféktif nganonaktipkeun ribozymes.Sanajan kitu, lamun lysate nu teuing kentel (kusabab eusi asam nukléat tinggi), ékstraksi PCI moal bisa stratify éféktif;nambahkeun leuwih lysate bisa ngabéréskeun masalah ieu.Sababaraha ékstraksi PCI bisa nyabut DNA residual leuwih.Lamun endapan bodas ngabentuk langsung saatos nambahkeun alkohol, éta nunjukkeun kontaminasi DNA.Ekstraksi ulang sareng PCI asam saatos disolusi tiasa ngaleungitkeun kontaminasi DNA.

4. Jaringan tutuwuhan: Jaringan tutuwuhan leuwih kompleks tinimbang jaringan sato.Sacara umum, pepelakan digiling dina kaayaan nitrogén cair, ku kituna dégradasi RNA ku énzim endogén jarang jarang.Lamun masalah degradasi teu ngumbar, éta ampir pasti disababkeun ku pangotor dikandung dina sampel.Kotoran anu aya dina seueur pepelakan bakal nyababkeun résidu, sareng alesan résidu sering kusabab pangotor ieu ngagaduhan sababaraha kamiripan sareng RNA: anjeun endapan sareng kuring endapan, sareng anjeun nyerep sareng kuring nyerep.Ciri-ciri ieu nangtukeun yén éta sambetan énzim anu kuat pisan.

Ayeuna, réagen ékstraksi RNA komérsial bisa diadaptasi ka ampir kabéh jaringan sato jeung pangaluyuan leutik, tapi aya sababaraha réagen ékstraksi RNA komérsial nu bisa cocog pikeun jaringan tutuwuhan paling.Untungna, Foregene tiasa nyayogikeun khususkit ékstraksi RNA tutuwuhan, Kami gaduhKit Isolasi RNA Total tutuwuhan, Tutuwuhan Total RNA Isolasi kit Ditambah.Anu terakhir dirarancang khusus pikeun pepelakan anu ngandung polisakarida sareng polifenol anu luhur.Pikeun ékstraksi RNA, eupan balik ti pamaké lab utamana alus.

12. Pangaruh beku sampel sarta thawing Sampel beku bisa jadi leuwih badag, sarta perlu dipotong saméméh dipaké pikeun ékstraksi RNA.Sampel condong ngalembereh (jigana sawaréh) nalika motong.Sampel beku meureun kudu ditimbang saméméh ékstraksi RNA, sarta thawing pasti bakal lumangsung salila prosés ieu.Sakapeung, thawing sampel ogé lumangsung salila prosés panggilingan nitrogén cair;atawa sampel beku langsung ditambahkeun kana lysate tanpa panggilingan nitrogén cair, sarta thawing pasti bakal lumangsung saméméh homogenization lengkep.Percobaan geus ditémbongkeun yén jaringan beku leuwih rentan ka degradasi RNA salila thawing ti jaringan seger.Alesan anu dipikaresep: Prosés freeze-thaw ngaganggu struktur dina sél, sahingga ngagampangkeun énzim endogen pikeun kontak langsung sareng RNA.

13. Penilaian kualitas RNA Biasana, éléktroforésis digunakeun pikeun nangtoskeun integritas RNA, sareng A260/A280 dianggo pikeun nangtoskeun kamurnian RNA.Sacara tiori, RNA utuh mibanda babandingan 28S:18S = 2.7:1, sarta lolobana data nekenkeun rasio 28S:18S = 2:1.Kanyataan yén ampir euweuh RNA sasari tina sampel lian ti sél dina nisbah 2: 1 (ieu dicandak ngagunakeun Agilent Bioanalyzer).

Hasil éléktroforésis RNA dipangaruhan ku sababaraha faktor, kalebet struktur sekundér, kaayaan éléktroforésis, beban sampel, darajat jenuh ku EB, jsb. Anggo éléktroforésis asli pikeun ngadeteksi RNA sareng nganggo Marker DNA salaku kontrol.Upami 28S dina 2kb sareng 18S dina 0.9kb jelas, sareng 28S: 18S > 1, integritas tiasa nyumponan sarat tina seueur percobaan salajengna.

A260 / A280 mangrupikeun indikator anu nyababkeun seueur kabingungan.Anu mimiti, perlu netelakeun harti aslina tina indikator ieu asam nukléat: RNA murni, na A260/280 = ngeunaan 2.0.RNA murni nyaéta 'sabab' jeung A260/A280 = 2 mangrupa 'pangaruh'.Ayeuna sadayana nganggo A260 / A280 salaku 'sabab', mikir yén "upami A260 / A280 = 2, maka RNA murni", anu sacara alami nyababkeun kabingungan.

Upami anjeun resep, anjeun tiasa nambihan réagen sakedik anu sering dianggo dina ékstraksi, sapertos fénol, guanidine isothiocyanate, PEG, sareng sajabana, kana conto RNA anjeun, teras ukur rasio A260 / A280.Kanyataanana seueur réagen anu dianggo pikeun ékstraksi RNA, ogé seueur najis dina sampel, nyerep sakitar A260 sareng A280, mangaruhan A260/A280.

Pendekatan anu paling instruktif ayeuna nyaéta nyeken conto RNA dina rentang 200-300 nm.Kurva RNA murni mibanda ciri-ciri kieu: kurvana mulus, A230 jeung A260 dua titik infleksi, A300 deukeut 0, A260/A280 = kira-kira 2,0, jeung A260/A230 = kira-kira 2,0.Upami data scan henteu sayogi, rasio A260/A230 kedah ogé ditangtukeun, sabab rasio ieu langkung sénsitip kana panyaluran sadaya pangotor anu mangaruhan réaksi énzimatik.Pertimbangkeun rentang linier alat (0.1–0.5 pikeun A260).

Aya dua fénoména mangpaat séjén: babandinganna bakal kirang langkung 0,3 langkung handap nalika A260/A280 diukur dina cai;sedengkeun rasio diukur dina 10 mM EDTA nyaeta ngeunaan 0,2 leuwih luhur batan nu diukur dina 1 mM EDTA.

Produk patali:

Cina Tutuwuhan Total RNA Isolasi Kit Produsén jeung Supplier |Foregene (foreivd.com)

RNA isolasi runtuyan Suppliers jeung Pabrik |Cina RNA isolasi runtuyan Produsen (foreivd.com)

Séri isolasi RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)