1. Pamahaman awal
Dina tahap ieu, urang kudu ngarti sababaraha konsep jeung terminologi, sangkan ulah nyieun kasalahan di hareup senior urang, kayaning:
Q: Naon bédana antara RT-PCR, qPCR, Real-time PCR, sareng real-time RT-PCR?
Jawaban: RT-PCR nyaéta PCR transkripsi balik(reverse transcription PCR, RT-PCR), nu mangrupakeun varian réa dipaké réaksi ranté polimérase (PCR).Di RT-PCR, untaian RNA ditranskripsi balik jadi DNA komplementer, nu lajeng dipaké salaku template pikeun amplifikasi DNA ku PCR.
Real-time-PCR sareng qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) nyaéta hal anu sarua, duanana mangrupakeun PCR kuantitatif real-time, nu hartina unggal siklus PCR boga rékaman data real-time, jadi jumlah template dimimitian bisa disaluyukeun analisis tepat.
Sanajan duanana Real-time PCR (real-time fluoresensi kuantitatif PCR) jeung Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) sigana disingget jadi RT-PCR, konvénsi internasional nyaéta: RT-PCR husus nujul kana transkripsi sabalikna.PCR , Real-time PCR umumna disingget jadi qPCR (quantitative real-time PCR).
Jeung real-time RT-PCR (RT-qPCR), Ieu teh PCR transkripsi sabalikna digabungkeun jeung téhnologi kuantitatif fluoresensi.: mimitina ménta cDNA (RT) ti RNA transkripsi sabalikna, lajeng nganggo Real-time PCR pikeun analisis kuantitatif (qPCR).Kaseueuran laboratorium ngalakukeun RT-qPCR, nyaéta, panalungtikan ngeunaan ekspresi RNA turun-regulasi, janten qPCR anu diomongkeun ku sadayana di laboratorium leres-leres ngarujuk kana RT-qPCR, tapi ulah hilap yén masih aya seueur tés DNA dina aplikasi klinis.Analisis kuantitatif, sapertos deteksi virus hépatitis B HBV.
Patarosan: Saatos maca loba PCR kuantitatif fluoresensi, naha sempalan amplified kudu dikawasa dina rentang 80-300bp?
Waleran: Panjang unggal runtuyan gén béda, sababaraha sababaraha kb, sababaraha ratusan bp, tapi urang ngan kudu merlukeun panjang produk janten 80-300bp nalika ngarancang primers, pondok teuing atawa panjang teuing teu cocog pikeun deteksi PCR kuantitatif fluoresensi .Fragmén produk pondok teuing pikeun dibédakeun tina primer-dimer.Panjang primer-dimer sakitar 30-40bp, sareng hese ngabédakeun naha éta dimer primer atanapi produk upami kirang ti 80bp.Lamun sempalan produk panjang teuing, ngaleuwihan 300bp, éta bakal gampang ngakibatkeun efisiensi amplifikasi low sarta teu bisa éféktif ngadeteksi jumlah gén.
Salaku conto, nalika anjeun ngitung sabaraha jalma anu aya di kelas, anjeun ngan ukur kedah ngitung sabaraha sungut anu aya.Sami bener mun anjeun ngadeteksi gén, Anjeun ngan perlu ngadeteksi runtuyan tangtu gén keur ngagambarkeun Sakabéh runtuyan bakal ngalakukeun.Upami anjeun hoyong ngitung jalma, anjeun kedah ngitung sungut sareng irung, ceuli sareng gelas, sareng gampang ngalakukeun kasalahan.
Pikeun ngalegaan, dina panalungtikan biologis, aya loba kasus panalungtikan ti titik ka wewengkon, sabab runtuyan gén spésiés nu mana wae nu panjang pisan, teu perlu jeung teu mungkin pikeun ngukur sakabéh fragmen, kayaning sequencing 16S baktéri, nu keur ngalaksanakeun runtuyan konservatif baktéri Assays mun infer jumlah populasi tangtu baktéri.
Q: Naon panjangna optimal pikeun desain primer qPCR?
Waleran: Umumna disebutkeun, panjang Primer nyaeta ngeunaan 20-24bp, nu hadé.Tangtosna, urang kedah nengetan nilai TM tina Primer nalika ngarancang Primer, sabab ieu patali jeung suhu annealing optimal.Saatos seueur percobaan, parantos kabuktosan yén 60 ° C mangrupikeun nilai TM anu langkung saé.Lamun suhu annealing teuing low, éta bakal gampang ngakibatkeun Gedekeun non-spésifik.Lamun hawa annealing teuing tinggi, efisiensi amplifikasi bakal rélatif low, puncak kurva amplifikasi bakal ngamimitian engké, sarta nilai CT bakal nyangsang.
Q: Kumaha cara ngalelep béda ti métode usik?
Jawaban: Métode ngawarnaanSababaraha pewarna fluoresensi, sapertos SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, sareng sajabana, henteu ngaluarkeun cahaya nyalira, tapi bakal ngaluarkeun fluoresensi saatos ngariung kana alur minor DNA untaian ganda.Ku alatan éta, dina awal réaksi PCR, mesin teu bisa ngadeteksi sinyal fluoresensi.Nalika réaksina ngahontal tahap annealing-extension, untaian ganda dibuka, sarta untaian anyar disintésis dina aksi DNA polimérase, sarta molekul fluoresensi ngiket kana alur minor dsDNA.Nalika jumlah siklus PCR nambahan, beuki loba pewarna digabungkeun jeung DNA untaian ganda, sarta sinyal fluoresensi ogé terus ditingkatkeun.Métode ngalelep utamana dipaké dina panalungtikan ilmiah.
PS: Ati-ati nalika ngalakukeun ékspérimén, pewarna kedah digabungkeun sareng DNA manusa, ati-ati janten jalma fluoresensi.
Metode pewarna (kénca) Metode usik (katuhu)
PS: Ati-ati nalika ngalakukeun ékspérimén, pewarna kedah digabungkeun sareng DNA manusa, ati-ati janten jalma fluoresensi.
SYBR Green Ⅰ ngabeungkeut kana alur minor DNA
Métode usikusik Taqman nyaéta usik hidrolisis anu paling sering dianggo.Aya grup fluoresensi dina tungtung 5′ usik, biasana FAM, sarta usik sorangan mangrupa runtuyan pelengkap gén target.Aya grup quenching fluoresensi dina tungtung 3 '.Numutkeun prinsip éndah énérgi foloresce flores (flets fringTip, fret), nalika molektur fluekesensi evyuring) sareng liburan anu ditampi (sedengkeun autroror oléksi lemah.Ku alatan éta, dina awal réaksi PCR, nalika usik bébas tur gembleng dina sistem, grup fluoresensi reporter moal emit fluoresensi.Nalika annealing, Primer jeung usik ngabeungkeut template.Salila tahap extension, polimérase terus sintésis ranté anyar.DNA polimérase miboga aktivitas exonuclease 5′-3′.Nalika ngahontal usik, polimérase DNA bakal ngahidrolisis usik tina citakan, misahkeun grup fluoresensi reporter ti grup fluoresensi quencher, sarta ngaleupaskeun sinyal fluoresensi.Kusabab aya hubungan hiji-ka-hiji antara usik jeung citakan, metoda usik téh punjul ti metoda ngalelep dina hal akurasi sarta sensitipitas tina tés.Metoda usik utamana dipaké dina diagnosis.
Q: Naon kuantitas mutlak?Naon Quantification Relatif?
Waleran: Kuantifikasi absolut nujul kana itungan jumlah salinan awal sampel nu bakal diuji ku qPCR, saperti sabaraha virus HBV dina 1ml getih.Hasil anu diala ku kuantifikasi relatif nyaéta parobahan dina jumlah gén target dina sampel husus relatif ka sampel rujukan sejen, sarta ekspresi gén up-diatur atawa handap-diatur.
Q: Naha jumlah ékstraksi RNA, efisiensi transkripsi sabalikna, sareng efisiensi amplifikasi mangaruhan kana hasil ékspérimén?
P: Naha panyimpen sampel, réagen ékstraksi, réagen transkripsi ngabalikkeun, sareng bahan-bahan pangirim cahaya mangaruhan kana hasil ékspérimén?
P: Métode naon anu tiasa ngabenerkeun data ékspérimén?
Ngeunaan masalah ieu, kami bakal ngajelaskeun sacara rinci dina bagian maju sareng maju di handap.
2. pangaweruh canggih
Ngeunaan PCR kuantitatif fluoresensi sacara real-time, urang kedah ngakuan kanyataan yén rébuan makalah panalungtikan ilmiah diterbitkeun unggal taun, diantarana téknologi PCR kuantitatif fluoresensi sanés sajumlah leutik.
Upami teu aya standar umum pikeun ngukur ékspérimén PCR kuantitatif fluoresensi, hasilna tiasa bénten pisan.Pikeun gén anu sami tina spésiés anu sami, kalayan metode pangolahan anu sami, hasil deteksi ogé bakal rupa-rupa, sareng bakal sesah pikeun anu telat ngulang hasil anu sami.Anjeun Teu aya anu terang mana anu leres sareng mana anu salah.
Naha ieu hartosna PCR kuantitatif fluoresensi mangrupikeun téknologi curang atanapi téknologi anu teu tiasa dipercaya?Henteu, éta kusabab PCR kuantitatif fluoresensi langkung sénsitip sareng langkung akurat, sareng operasi anu salah sakedik bakal ngahasilkeun hasil anu sabalikna.Karugian leutik sarébu mil jauhna.Nu nulis artikel bisa jadi sababaraha kali disiksa ku reviewers.Dina waktu nu sarua, nu reviewers jurnal ogé hésé milih tina hasil eksperimen béda.
Sadayana, nunjukkeun kurangna konsensus dina percobaan PCR sacara real-time.Pikeun tujuan ieu, para ilmuwan senior di industri mimiti ngarumuskeun standar,merlukeun kontributor nyadiakeun sababaraha ékspérimén jeung ngolah data rinci diperlukeun (kaasup data diperlukeun) dina artikel pikeun minuhan standar ieu.
Reviewers tiasa nangtoskeun kualitas percobaan ku maca rinci ieu;pamiarsa hareup ogé bisa make ieu malikan percobaan atawa ningkatkeun percobaan.Lajeng hasil ékspérimén diala ku cara kieu pinuh ku informasi, kualitas luhur, sarta bisa dipaké.
MIBBI (Inpormasi Minimum pikeun Investigasi Biologis sareng Biomédis -http://www.mibbi.org) ngawujud.MIBBI mangrupikeun proyék anu nyayogikeun standar pikeun ékspérimén.Ieu diterbitkeun di alam.proyék ieu aimed di sagala rupa percobaan biologis, kaasup biologi sél, Microarray, qPCR urang bade ngabahas ayeuna, jeung sajabana, jeung nyadiakeun keur unggal jenis percobaan nalika ngirimkeun naskah.Inpormasi éta kedah disayogikeun unggal waktos.
Dina proyék MIBBI, aya dua artikel anu patali jeung PCR kuantitatif fluoresensi, nyaéta:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – basa terstruktur sareng pituduh ngalaporkeun pikeun data PCR kuantitatif sacara real-time;
·MIQE (Inpormasi Minimum pikeun Publikasi Percobaan PCR Real-Time Kuantitatif) - inpormasi minimum pikeun nyebarkeun artikel ngeunaan percobaan PCR kuantitatif sacara real-time.
Kahiji, hayu urang ngobrol ngeunaan RDML, spésifikasi terminologi.
Upami teu aya definisi standar pikeun sadayana, mustahil pikeun neraskeun diskusi, naha éta katerangan istilah penting pisan dina ujian.
Terminologi anu digunakeun dina percobaan PCR kuantitatif fluoresensi ngawengku eusi di handap ieu.QIAGEN parantos ngadamel kasimpulan anu pangsaéna pikeun urang.Di handap ieu sadayana garingbarang .
Kurva amplifikasi
Kurva amplifikasi nujul kana kurva dijieun salila prosés PCR, kalawan jumlah siklus salaku abscissa jeung inténsitas fluoresensi real-time salila réaksi salaku ordinate.
Kurva amplifikasi anu saé kedah gaduh ciri-ciri ieu: dasarna datar atawa rada turun, sarta teu aya trend luhur atra;titik infleksi kurva jelas, sarta lamping fase éksponénsial sabanding jeung efisiensi amplifikasi.Nu leuwih gede lamping, nu leuwih luhur efisiensi amplifikasi;kurva amplifikasi sakabéh Paralelisme alus, nunjukkeun yén efisiensi amplifikasi unggal tube sarua;fase eksponensial kurva amplifikasi sampel konsentrasi-rendah atra.
Dasar (Baseline)
Dasarna nyaéta tingkat bising tina siklus awal, biasana diukur antara siklus 3 jeung 15, sabab kanaékan nilai fluoresensi disababkeun ku produk amplifikasi teu bisa ditandaan salila periode ieu.Jumlah siklus dipaké pikeun ngitung baseline bisa rupa-rupa sarta bisa jadi kudu ngurangan lamun jumlah template tinggi dipaké atawa lamun tingkat ekspresi gén target tinggi.
Nyetél garis dasar merlukeun ningali data fluoresensi tina kurva amplifikasi linieritas.Garis dasar diatur supados tumuwuhna kurva amplifikasi dimimitian ku jumlah siklus anu langkung ageung tibatan nomer puncak siklus dasar.Baselines kudu diatur individual pikeun tiap runtuyan target.Nilai fluoresensi rata-rata anu dideteksi dina siklus awal kedah dikurangan tina nilai fluoresensi anu dicandak dina produk anu diamplifikasi.Versi panganyarna tina rupa-rupa software Real-Time PCR ngamungkinkeun optimasi otomatis setelan dasar pikeun sampel individu.
Salila sababaraha siklus mimiti réaksi amplifikasi PCR, sinyal fluoresensi teu robah teuing.Ngadeukeutan hiji garis lempeng disebut garis dasar, tapi lamun urang kasampak raket dina sababaraha siklus munggaran, urang nempo yén dina dasar aya naon anu lumangsung dina gambar di handap ieu.
Latar Latar nujul kana
nilai fluoresensi non-spésifik dina réaksi.Contona: inefficient fluorescence quenching;atawa sajumlah badag témplat DNA untaian ganda alatan pamakéan SYBR Héjo.Komponén latar tukang sinyal dihapus sacara matematis ku algoritma software PCR Real-Time.
Sinyal reporter
Sinyal reporter nujul kana sinyal fluoresensi dihasilkeun ku SYBR Green atanapi fluoresensi dilabélan panyilidikan runtuyan-spésifik salila Real-Time PCR.
Sinyal Reporter Normalisasi (RN)
RN nujul kana inténsitas fluoresensi tina ngalelep reporter dibagi inténsitas fluoresensi tina ngalelep rujukan pasip diukur dina unggal siklus.
Pewarna Rujukan Pasip
Dina sababaraha PCR Real-Time,ngalelep fluoresensi ROX dipaké salaku rujukan internal pikeun normalize sinyal fluoresensi.Koréksi pikeun variasi alatan pipetting teu akurat, posisi sumur, sarta fluctuations fluoresensi dina dasar well-demi-sumur.
Ambang fluoresensi (ambang)
ieu disaluyukeun luhureun nilai tukang sarta nyata handap nilai dataran tina kurva amplifikasi.Éta kedah aya dina daérah linier kurva amplifikasi, ngalambangkeun rentang log-linier tina deteksi PCR.Ambang kudu disetel dina tampilan kurva log-amplifikasi supados fase log-linier PCR gampang diidentipikasi.Lamun aya sababaraha gén target dina Real-Time PCR, bangbarung kudu disetel pikeun tiap target .Sacara umum, sinyal fluoresensi tina 15 siklus mimiti réaksi PCR dipaké salaku sinyal tukang fluoresensi, jeung bangbarung fluoresensi nyaéta 10 kali simpangan baku tina sinyal fluoresensi tina 3 nepi ka 15 siklus PCR munggaran, sarta bangbarung fluoresensi diatur dina fase éksponénsial tina amplifikasi PCR.Sacara umum, unggal alat gaduh ambang fluoresensi sateuacan dianggo.
Cycle Threshold (CT) atanapi Crossing Point (CP)
Siklus di mana kurva amplifikasi meuntas bangbarung (ie, titik di mana deteksi fluoresensi ngaronjat sacara signifikan).CT tiasa janten fraksi sareng jumlah template awal tiasa diitung.Nilai CT ngagambarkeun jumlah siklus ngalaman nalika sinyal fluoresensi dina unggal tube réaksi PCR ngahontal bangbarung set.Aya hubungan linier antara nilai CT unggal citakan jeung logaritma angka salinan awal citakan,leuwih luhur jumlah salinan awal, nu leutik nilai CT, sarta sabalikna.Kurva baku bisa dijieun ku cara maké standar kalawan nomer salinan awal dipikawanoh, wherein abscissa ngagambarkeun nilai CT, sarta ordinate ngagambarkeun logaritma tina angka salinan awal.Ku alatan éta, salami nilai CT tina sampel kanyahoan dicandak, jumlah salinan awal sampel bisa diitung tina kurva baku.
nilai ΔCT
nilai ΔCT ngajelaskeunbédana antara gén target jeung nilai CT gén rujukan endogenous pakait, kayaning gén housekeeping, sarta dipaké pikeun normalize jumlah template dipaké:
⇒ΔCT = CT (gén target) - CT (gén rujukan endogenous)
Nilai ΔΔCT
Nilai ΔΔCT ngajelaskeun bédana antara nilai rata-rata ΔΔCT tina sampel anu dipikaresep (contona, sél anu dirangsang) sareng nilai rata-rata ΔΔCT tina sampel rujukan (contona, sél anu teu dirangsang).Sampel rujukan disebut ogé sampel kalibrasi sareng sadaya conto sanés dinormalisasi kana ieu pikeun kuantitas relatif:
⇒ΔΔCT = rata-rata ΔCT (sampel dipikaresep) - rata-rata ΔCT (sampel rujukan)
Gén rujukan endogén (gén rujukan endogen)
Tingkat éksprési gén rujukan endogen, sapertos gén rumah tangga (gén rumah tangga), henteu béda-béda antara sampel.Ngabandingkeun nilai CT tina gén rujukan ka gén target ngamungkinkeun tingkat éksprési gén target bisa dinormalisasi kana jumlah input RNA atawa cDNA (tingali bagian dina nilai ΔCT luhur).
Gén rujukan internal bener keurmungkin degradasi RNA atawa ayana inhibitor énzim dina sampel RNA, kitu ogé variasi dina eusi RNA, efisiensi transkripsi sabalikna, recovery asam nukléat, sarta penanganan sampel.Pikeun milih gén rujukan optimal (s), urang dirobah algoritma pikeun ngidinan pilihan na tina rujukan optimal gumantung kana setting eksperimen.
Kadali internal
Runtuyan kontrol anu diamplifikasi dina réaksi nu sarua jeung runtuyan udagan sarta usik ku usik béda (ie, ngajalankeun duplex PCR).Kadali internal sering dianggo pikeun ngaluarkeun amplifikasi anu gagal, sapertos nalika sekuen target henteu dideteksi.
Sampel Kalibrasi
Sampel rujukan (contona, RNA dimurnikeun tina garis sél atawa jaringan) dipaké dina kuantifikasi relatif pikeun ngabandingkeun sakabéh sampel séjén pikeun nangtukeun tingkat ekspresi relatif gén.Sampel calibration tiasa wae sampel, tapi biasana mangrupa kontrol (contona, sampel untreated atawa sampel ti waktu enol percobaan).
Kadali positip
make réaksi kontrol jeungjumlah dipikawanoh template.Kadali positip sering dianggo pikeun mariksa yén sét primer atanapi sét usik primer berpungsi leres sareng yén réaksina diatur leres.
Teu aya Kontrol Citakan (NTC)
Réaksi kontrol nu ngandung sakabéh komponén perlu réaksi amplifikasi iwal template, nu biasana diganti ku cai.Pamakéan NTC bisa manggihan kontaminasi disababkeun ku kontaminasi réagen atawa DNA asing, sahingga mastikeun kaaslian jeung reliabilitas data deteksi.Amplifikasi kontrol NTC nunjukkeun kontaminasi.
Henteu aya kontrol RT (NRT)
Prosés ékstraksi RNA bisa ngandung residual DNA génomik, nu pisan ngabahayakeun sarta mangrupakeun penjahat mangaruhan kualitas data jeung musuh alam qPCR, jadi nalika ngarancang percobaan, éta kudu dirancang ukur pikeun ngagedékeun deteksi RNA.Aya dua cara, hiji nyaéta mendesain primer dina intron, anu sanésna nyaéta ngaleungitkeun DNA lengkep, mana anu langkung saé, anu bakal dibahas engké.Kontrol NTR mangrupikeun eunteung sihir pikeun ngadeteksi polusi DNA.Mun aya amplifikasi, hartina aya polusi.
Standar
Standar mangrupikeun conto konsentrasi anu dipikanyaho atanapi nomer salinan anu dianggo pikeun ngawangun kurva standar.Pikeun mastikeun stabilitas standar, fragmen gen biasana diklon kana plasmid sareng dianggo salaku standar.
Kurva standar
biasana diluted kana sahanteuna 5 gradién konsentrasi jeung produk baku nurutkeun babandingan duka kali, jeung 5 titik digambar dina koordinat nilai CT jeung nomer salinan, sarta titik disambungkeun pikeun ngabentuk garis pikeun ngahasilkeun kurva baku.Pikeun unggal kurva standar, validitasna kedah dipariksa.Nilai lamping ragrag antara -3,3 jeung -3,8, sarta unggal konsentrasi dipigawé dina triplicate.Titik anu béda sacara signifikan tina titik anu sanés kedah dipiceun.Nilai CT tina sampel anu bakal diuji dibawa kana kurva standar, sareng tingkat éksprési sampel anu badé diuji tiasa diitung.
Nilai CT tina sampel anu bakal diuji dibawa kana kurva standar, sareng nomer salinan awal sampel anu bakal diuji tiasa diitung.
Efisiensi jeung lamping
Kemiringan kurva standar ngagambarkeun efisiensi PCR sacara real-time.
· Kemiringan -3.322 nunjukkeun yén efisiensi amplifikasi PCR nyaéta 1, atanapi 100% éfisién, sareng jumlah produk PCR dua kali dina unggal siklus.
· Kemiringan kurang ti -3,322 (misalna, -3,8) nunjukkeun efisiensi PCR
· A lamping leuwih gede ti –3.322 (misalna, –3.0) nunjukkeun yén efisiensi PCR sigana leuwih gede ti 100%, nu panasaran, kumaha hiji siklus PCR bisa ngahasilkeun leuwih ti ganda produk amplified?Kaayaan ieu lumangsung dina fase non-linier tina réaksi PCR, nyaeta, aya jumlah badag amplifikasi non-spésifik.
kurva lebur
Saatos amplifikasi qPCR réngsé, produk PCR dipanaskeun.Nalika suhu naék, produk amplifikasi untaian ganda laun-laun ngalebur, nyababkeun panurunan dina inténsitas fluoresensi.Nalika suhu tangtu (Tm) ngahontal, sajumlah ageung produk bakal ngalembereh.Fluoresensi turun nyirorot.Produk PCR anu béda gaduh nilai Tm anu béda sareng suhu lebur anu béda, ku kituna spésifisitas PCR tiasa diidentifikasi.
Kurva lebur (kurva turunan)
Kurva lebur diturunkeun pikeun ngabentuk peta puncak, anu tiasa langkung intuitif nunjukkeun kaayaan fragmen produk PCR.Kusabab suhu lebur nyaéta nilai Tm tina sempalan DNA, sababaraha parameter anu mangaruhan nilai Tm tina sempalan DNA bisa judged, kayaning ukuran sempalan, eusi GC, jsb Umumna disebutkeun, nurutkeun prinsip design Primer urang,panjang produk amplified nyaeta dina rentang 80-300bp, jadi suhu lebur kudu antara 80 ° C jeung 90 ° C.
Interprétasi kurva lebur: Lamun hijina puncak utama mucunghul antara 80 ° C-90 ° C, hartina PCR kuantitatif fluoresensi sampurna;lamun puncak utama némbongan antara 80°C-90°C jeung rupa-rupa puncak némbongan handap 80°C, dimer primer dianggap dasarna.Anjeun tiasa nyobian ningkatkeun suhu annealing pikeun ngajawab éta;lamun puncak utama némbongan antara 80 ° C-90 ° C, sarta puncak rupa-rupa némbongan deui nalika hawa naék, éta dasarna dianggap yén aya kontaminasi DNA, sarta DNA perlu dihapus dina tahap awal percobaan.
Tangtosna, masih aya sababaraha kaayaan anu teu normal, anu bakal dirobih hiji-hiji di handap.
3. pangaweruh canggih
Pikeun ngalakukeun qPCR, kuring kedah nyarios MIQE,Émbaran minimumpikeun Publikasi tinaKuantitatifReal-Time PCRÉkspérimén — inpormasi minimum pikeun nyebarkeun tulisan ngeunaan PCR kuantitatif sacara real-timepercobaan .Pikeun nyederhanakeun pamahaman dulur, urang bakal nyederhanakeun eusi konci.
Anjeun tiasa milarian téks aslina tina MIQE on Internét, jeung hal pangpentingna nyaéta yén éta stipulates nuDaptar pariksa data anu kedah disayogikeun nalika nyebarkeun tulisan .
Reviewers tiasa nangtoskeun kualitas percobaan ku maca rinci ieu;pamiarsa hareup ogé bisa ngagunakeun ieu pikeun ngulang atawa ningkatkeun percobaan.
Perlu dicatet yén dina daptar ieu, pentingna unggal daptar ditandaan ku E atanapi D masing-masing.Naon éta hartosna?E: inpormasi penting (kudu dikintunkeun);D: informasi desirable (nyadiakeun saloba mungkin).
MIQE (1) -Desain ékspériméntal
Loba scumbags anu geus réngsé pertahanan maranéhanana sanggeus réngsé studi sarjana maranéhanana moal nyaho kumaha carana ngarancang hiji percobaan mandiri, buka notebooks maranéhanana, sarta ngalakukeun naon guru ngabejaan aranjeunna.Hasilna, desain ékspérimén henteu ketat, sareng departemén redaksi majalah nyarios yén aranjeunna hoyong ngadamel gambar ieu sareng gambar éta, ku kituna aranjeunna ngalakukeunana.Ieu kumaha scumbags dijieun!
Deukeut ka imah, prinsip kahiji percobaan nyaéta pikeun nangtukeunrigor logika ékspérimén.Hal anu paling dasar nyaéta desain ékspérimén, sarta hal anu paling penting ngeunaan desain ékspérimén nyaéta kumaha nangtukeun sampel udagan, sampel acuan (kontrol), jeung jumlah ulangan, sangkan data ékspérimén bisa jadi référénsi, bisa dibandingkeun, jeung ngayakinkeun.
Sampel sasarannujul kana sampel nu merlukeun urang pikeun ngadeteksi gén target sanggeus perlakuan tangtu.Sampel rujukannyaéta sampel tanpa perlakuan naon, nu mindeng disebut tipe liar dina biologi.
Réplikasi ékspériménpenting pisan.Sacara umum, jumlah ulangan persuasif kudu leuwih ti tilu.Perlu ngabédakeun naon réplikasi biologis sareng naon réplikasi téknis.
Réplika biologis: Percobaan verifikasi sarua dipigawé ku bahan béda (waktu, tutuwuhan, bets, pelat réaksi).
Duplikasi biologis
Hayu urang nyandak perlakuan péstisida lada salaku conto.Kami hoyong menyemprot péstisida dina tilu pepelakan ABC, teras tilu pepelakan ABC mangrupikeun tilu ulangan biologis, sareng aranjeunna percobaan verifikasi anu sami sareng bahan anu béda.Tapi salaku percobaan, kontrol a pasti diperlukeun, sangkan bisa menyemprot salah sahiji cabang tutuwuhan A pikeun ngabentuk grup ékspérimén tutuwuhan A, sarta henteu menyemprot cabang séjén tutuwuhan A pikeun ngabentuk grup kontrol.Laksanakeun hal anu sami pikeun B sareng C.
Réplika Téknis (Replika Téhnis): Ieu percobaan ulang dirancang pikeun nyegah kasalahan disababkeun ku operasi, nu sabenerna mangrupa duplikat liang kaasup dina bahan anu sarua.Duanana perlakuan sareng kontrol kedah gaduh réplikasi setélan (minimal tilu) tina gén target sareng gén rujukan internal.
pengulangan teknis
Candak cabé diolah kalayan péstisida sabagé conto deui.Pikeun grup ékspérimén tutuwuhan A, urang nyieun tilu liang PCR 1, 2, jeung 3 pikeun gén target na gén rujukan internal masing-masing, ku kituna nyandak rata sanggeus deteksi.Pikeun kontrol tutuwuhan A Grup ogé dirawat ku cara nu sami.Nya kitu, lakukeun perlakuan anu sami pikeun pepelakan B sareng C.Ieu pengulangan teknis.
Eta sia noting yénAnu asup kana statistik nyaéta pengulangan biologis, sareng pengulangan téknis nyaéta pikeun nguji naha aya fénoména acak dina prosés ékspérimén, supados hasil ékspérimén tiasa dipercaya, nyaéta, pikeun ngahindarkeun kasalahan ku cara nyandak rata-rata sapertos anu sering urang sebutkeun.
Kontrol négatip-NTC sareng NRT
NTC (No-Template Control), kontrol tanpa citakan, dipaké pikeun pariksa naha bahan ékspérimén kacemar.Sacara umum, cai dipaké salaku citakan.Upami aya réaksi fluoresensi, éta nunjukkeun kontaminasi asam nukléat di laboratorium.
Polusi ieu asalna tina: cai najis, réagen teu minuhan sarat ngandung DNA endogenous, polusi primer, polusi alat laboratorium, polusi aerosol, jeung sajabana, perlu ngagunakeun scavengers RNase jeung sambetan RNase.Polusi aerosol anu paling hese dipendakan.Bayangkeun laboratorium anjeun sapertos smog, kalayan sagala rupa asam nukléat ditunda dina hawa.
NRT (No-Reverse Transcriptase), kontrol tanpa transkripsi sabalikna, nyaéta RNA non-reverse ditranskripsi salaku kontrol négatip, nu kontrol résidu gDNA.
Nalika ngalakukeun ekspresi gen, jumlah RNA dideteksi ku ngadeteksi jumlah cDNA saatos transkripsi sabalikna.Upami aya résidu gDNA nalika RNA dimurnikeun, éta bakal nyababkeun kasalahan dina hasil ékspérimén, sabab hasil anu aktual nyaéta gDNA sareng cDNA.Dina tingkat agrégat, teu ngan cDNA, gDNA perlu sagemblengna dipiceun salila ékstraksi RNA.
MIQE (2) -inpo sampel
Nu disebut informasi sampel hartina lamun urang nyebarkeun artikel ngeunaan qPCR, urang kudu ngajelaskeun informasi sampel jelas, nu mangrupa bagian indispensable tina artikel.Nya kitu, nalika urang ngolah sampel, urang ogé kudu ngatur operasi urang sorangan pikeun mastikeun validitas sampel.
Katerangan ngeunaan sampel ngan hasil, sarta kami kudu nengetan leuwih kana bahan dicokot salila sakabeh percobaan.
Pamilihan bahan ékspérimén
Sampel getih - pilih getih seger, henteu langkung ti 4 jam.Sampel sél - milih pikeun ngumpulkeun sél seger dina periode tumuwuhna vigorous.Jaringan Sato—Pilih jaringan anu seger, tumuwuh kuat.Jaringan Tutuwuhan - Pilih jaringan ngora anu seger.
Anjeun kedah perhatikeun yén aya kecap konci dina sababaraha kalimat ieu: seger.
Pikeun conto di luhur, kit anu pangsaéna, murah, sareng stabil di pasar nyaéta kit Foregene, anu tiasa gancang sareng gampang nimba DNA sareng RNA na.
Tutuwuhan Total RNA Isolasi Kit
Tutuwuhan Total RNA Isolasi Kit Ditambah
Panyimpenan bahan ékspérimén
Sacara umum, kami henteu nyarankeun nyimpen conto, upami kaayaan ngamungkinkeun.Nanging, seueur réréncangan anu teu tiasa ngalaksanakeun ékspérimén langsung saatos sampling, sareng sawaréh kedah nyandak tangki nitrogén cair ka lapangan pikeun sampling.
Pikeun jenis ieu sobat teuas-kerja, abdi ngan bisa disebutkeun yen anjeun teu ngarti consumables réagen.Ayeuna loba pausahaan consumable réagen ngahasilkeun réagen nu bisa nyimpen sampel RNA dina suhu kamar, sarta anjeun bisa milih ngagunakeun eta.Métode panyimpen konvensional nyaéta neundeun nitrogén cair, nganggo tanki nitrogén cair leutik anu gampang dibawa.Sanggeus mawa sampel deui ka laboratorium, nyimpen dina kulkas -80 ° C.
Pikeun percobaan ngalibetkeun RNA, prinsip genep kecap kudu dituturkeun:suhu rendah, teu aya énzim,jeunggancang .
Konsep suhu low gampang kahartos;tanpa énzim, RNase nyaeta madhab di dunya urang hirup di (disebutkeun anjeun bakal geus ditelasan ku HIV), jadi kumaha carana ulah RNase nalika ngalakukeun percobaan mangrupakeun konsép pohara penting;gancang,Henteu aya Kung Fu di dunya anu teu tiasa dipegatkeun, ngan laju anu teu tiasa dipegatkeun.
Ku alatan éta, dina rasa, nu pondok waktu ékstraksi, nu hadé kit.Naha teuForegene'S kit nekenkeun speed, sabab nyaho eta oge.
PS: Sababaraha katresna ngalakukeun percobaan taliti pisan, tapi maranéhna teu jadi alus salaku slam dunk sanggeus sababaraha taun gawé.Maranéhna ngarasa yén Allah teu adil, ngawadul ka batur, jeung néangan kahirupan.Malah, manéhna teu ngarti.Anjeunna teu ngajaga RNA ogé, sarta pamaén slam dunk éta gesit.Nalika anjeunna ngalakukeun ékspérimén, anjeunna ngira yén anjeunna bakal ngabéréskeun slam dunk kalayan tilu kali, lima kali sareng dua divisi, tapi anjeunna ngalakukeun ékspérimén ogé.
Catetan: Laun, leuwih Chances invasi RNase.Kumaha ngalatih diri pikeun gancang?Teu aya cara, ngan latihan deui.
Pikeun percobaan béda jeung sampel béda, masih perlu maca leuwih literatur jeung milih hiji métode luyu pikeun ngolah.Pikeun ngumpulkeun sampel sarta prosés neundeun, MIQE merlukeun yén éta kudu jelas ditulis dina kertas, ku kituna reviewers bisa marios reliabiliti kertas, sarta eta oge merenah pikeun barudak stunned malikan percobaan Anjeun.
Sanajan percobaan biologis hese, aranjeunna high-end.Upami anjeun henteu ati-ati, anjeun tiasa ngagulingkeun dunya.Contona, ngajadikeun SARS jadi krisis biokimia, atawa nyieun béas hibrid pikeun nyalametkeun 1,3 miliar jelema.Gambar di handap ieu mangrupikeun percobaan kimia, anjeun kedah ngartos kumaha reueus anjeun kana panilitian anjeun ngan ukur ningali penampilan anu sapertos kontol.Poho deui, tong hideng baé.
MIQE (3) - ékstraksi asam nukléat.
Ékstraksi asam nukléat mangrupikeun kajadian anu ageung, sareng sadaya percobaan biologi molekular dimimitian ku ékstraksi asam nukléat.Anu mimiti, hayu urang nyalin eusi MIQE ngeunaan ékstraksi asam nukléat.
Ningali bentuk ieu, anjeun moal tiasa cicing dina permukaan.Bentukna nyaéta dogma.Pikeun janten murid anu luhur, anjeun kedah naroskeun naha.Eusi penting dina tabél ieu nyaéta: Ngudagpurity, integritas, konsistensi, jeung jumlah ékstraksi RNA .
Bagian kahiji tinaprosés atawa instrumen mangrupa léngkah ékstraksi asam nukléat.Upami anjeun nganggo ékstrak asam nukléat otomatis pikeun ékstrak (canggih, mangga ngahubungi kuring kanggo ngagaleuh), anjeun kedah nunjukkeun nami modél alat.
Ngaran kit jeung
kit naon anu dianggo pikeun detil parobihan, réagen khusus naon anu ditambihan atanapi operasi khusus anu dilakukeun kedah dijelaskeun sacara jelas supados batur tiasa gampang ngulang percobaan anjeun.
Sababaraha urang nambahkeun sababaraha réagen husus nalika extracting sampel husus, mikir yén ieu téh pakarang rusiah maranéhanana sarta ulah ngabejaan batur.Bari tetep rusiah, maranéhna ogé leungit kasempetan sangkan artikel anjeun caang.Tong pinter-pinter, kudu leuwih jujur batan Zhang baheula nagara dina panalungtikan ilmiah, mun hayang pinter mah artikelna bakal ngabobodo.
kudu inget nomer produk kitmun anjeun mesen kit jeung nulis artikel.Umumna aya dua angka dina kit: Cat-nomer katalog (nomer produk, nomer artikel), Lot-nomer loba produk (Dipaké pikeun nunjukkeun bets nu produk asalna).
Salaku tambahan, nomer CAS sering dianggo nalika mesen réagen biokimia, sareng kuring bakal ngapopulérkeunana babarengan.Nomer CAS nyaéta jumlah anu dipasihkeun ku American Chemical Society ka unggal ubar kimia anyar.Sacara umum, tilu angka disambungkeun ku dash a.Jumlah CAS Rushui: 7732-18-5.Bahan kimia sering gaduh sababaraha alias, tapi nomer CAS unik.Nalika mesen obat, anjeun tiasa pariksa heula nomer CAS na.
Deukeut ka bumi, naha urang kedah ngajelaskeun hal-hal ieu sacara jelas?Nyatana, éta ogé pikeun mariksa kualitas ékstraksi RNA.Pamakéan instrumen sareng kit bakal ngajantenkeun ékstraksi RNA langkung konsisten.Skala ékstraksi laboratorium biasa henteu ageung, sareng tiasa didapet ku kit.
Rincian perlakuan DNase atanapi RNase
Isu penting PCR kuantitatif fluoresensi nyaéta pikeun nyegah kontaminasi DNA, sareng ulah ékspérimén upami aya kontaminasi.Ku alatan éta, penting pisan pikeun nyatakeun prosés anu anjeun anggo pikeun ngolah DNA, pikeun nunjukkeun yén DNA dina prosés ékspérimén parantos dihapus lengkep sareng lengkep.digambarkeun ku diagram schematic.
Skéma diagram RNA jeung DNA
Sacara umum, padika pikeun ngaleungitkeun DNA nyaéta pikeun ngubaran RNA nganggo DNase saatos ékstraksi.Sanajan kitu, ieu métode rélatif heubeul.Kit ékstraksi RNA komérsial geus bisa miceun DNA salila prosés ékstraksi tanpa nambahkeun DNase.Contona, runtuyan kit ti Foregene.
Catetan: Nyoplokkeun DNA salila ékstraksi RNA mangrupakeun pedang double-edged pisan bahaya, nu bakal manjangkeun waktu operasi ékstraksi RNA jeung ningkatkeun resiko RNA degradasi.Dasarna, éta mangrupikeun trade-off antara ngahasilkeun RNA sareng kamurnian.
Sajaba ti éta, jumlah DNase ditambahkeun kana kolom adsorption basis silika pisan leutik, sarta kualitas luhur DNase kudu dipaké pikeun ngahontal éfék.DNase anu teu dioptimalkeun teu tiasa dicerna gancang sareng lengkep.Ieu mangrupikeun tés tingkat téknis padagang.Tangtu, aya malah leuwih aneh padagang anu boast yén DNA bisa dihapus tanpa DNase.Bisa disebutkeun yen saha anu brags yén DNA bisa sagemblengna dipiceun tanpa DNase mangrupakeun hooligan a.DNA mangrupikeun struktur untaian ganda anu kawilang stabil, sareng éta henteu tiasa dipupus ngan ku ngobrol sareng seuri.
Penilaian kontaminasi
métode assessment: deteksi éléktroforésis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, loading 1-3 ul
Analisis kuantitatif asam nukléat
biasana diukur maké spéktrofotométer UV.Hayu atuh ngapopulérkeun heula harti tina tilu nilai OD260, OD280, jeung OD230.
·OD260nm: Ieu teh panjang gelombang nyerep tina puncak nyerep pangluhurna asam nukléat, sarta nilai diukur pangalusna Bulan ti 0,1 nepi ka 1,0.Lamun henteu, éncér atawa konsentrasi sampel pikeun mawa eta dina rentang.
·OD280nm: Éta panjang gelombang nyerep tina puncak nyerep pangluhurna protéin jeung zat phenolic.
·OD230nm: Éta panjang gelombang nyerep tina puncak nyerep karbohidrat pangluhurna.
Salajengna, hayu urang ngobrol ngeunaan peran unggal indikator.Pikeun A260, éta tiasa dianggo pikeun ngukur ngahasilkeun asam nukléat.Lamun OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Pikeun kamurnian, urang kedah ningali babandingan anu biasa urang tingali: OD260/280 sareng OD260/230.
·DNA murni: OD260/280 kira-kira sarua jeung 1,8.Nalika éta langkung ageung tibatan 1,9, éta nunjukkeun yén aya polusi RNA, sareng nalika kirang ti 1,6, éta nunjukkeun yén aya polusi protéin sareng fénol.
RNA murni: 1.7
·OD260/230: Naha éta DNA atanapi RNA, nilai rujukan nyaéta 2,5.Nalika éta kirang ti 2.0, éta nunjukkeun yén aya polusi gula, uyah sareng bahan organik.
integritas RNA
Penting pisan pikeun ngukur integritas RNA.Sacara umum, perlu ngalakukeun percobaan gél denaturasi RNA pikeun mariksa naha kacaangan antara 28S sareng 18S RNA mangrupikeun hubungan dua kali.Nalika pita katilu 5S némbongan, hartina RNA geus mimiti nguraikeun, iwal invertebrata.
Data pikeun penilaian kualitas RNA: Salian tés di luhur, aya ogé sababaraha tés instrumen anu langkung maju dina hal integritas RNA, sapertos uji integritas RQI tina sistem éléktroforésis otomatis Experion, anu tiasa ngadeteksi naha RNA didegradasi sacara teu katingali.
Dina panalungtikan ilmiah, PCR kuantitatif fluoresensi nyaéta ngabandingkeun antara gén target sareng gén rujukan internal.Ku alatan éta, dina prosés pelestarian sampel RNA, ékstraksi RNA, jeung sajabana, tujuan utama nyaéta pikeun mastikeun integritas RNA.
Kumaha integritas RNA mangaruhan kasaimbangan antara gén target jeung gén rujukan internal bisa gampang dipikaharti tina gambar di handap ieu.Degradasi bakal ngakibatkeun incompleteness gén, naha éta téh incompleteness tina gén rujukan internal atawa incompleteness tina gén target, éta bakal boga dampak hébat kana data.
Diagram skéma tina gén target sareng gén rujukan, henteu kedah leres
Uji inhibisi (naha nilai CT diteken dina konsentrasi luhur atanapi rendah atanapi kaayaan sanésna)
Nyandak inohong ieu salaku conto, nilai Ct tina lima kurva nyaéta kieu.Distribusi nilai CT antara kurva henteu rata, sareng nilai Ct ditunda dina konsentrasi luhur sareng rendah, nyaéta kasus inhibisi PCR.
Poin konci: Dina prosés ékstraksi RNA, urang kudu abandon misconceptions sarta ngadegkeun leuwih bener.
Gagasan anu salah nyaéta: ékstraksi RNA ngan ukur ngahasilkeun hasil, mikir yén langkung ageung jumlah RNA anu dicandak, langkung saé.Nyatana, nalika urang ngalakukeun kuantifikasi, upami jumlah gén henteu ageung pisan, urang henteu peryogi seueur RNA.Jumlah RNA anjeun nimba leuwih ti cukup.
Konsep anu leres nyaéta:Ékstraksi RNA kedah ngudag kamurnian, integritas sareng konsistensi.Purity bisa mastikeun yén transkripsi sabalikna saterusna teu dihambat sarta data moal kapangaruhan ku DNA.Integritas mastikeun kasaimbangan urutan target sareng rujukan internal.Konsistensi ensures stabil loading sampel.
MIQE (4) - transkripsi sabalikna
Salah sangka: ngungudag volume sampel nu leuwih luhur.
Konsép anu leres: Ngudag konsistensi (stabilitas), paduli jumlah RNA dimuat, efisiensi transkripsi sabalikna tetep konsisten, mastikeun yén béda dina cDNA sabenerna bisa ngagambarkeun béda dina mRNA.
Kami ngajelaskeun prosés ieu kalayan diagram skématik:
Diagram skéma tina efisiensi transkripsi sabalikna, henteu leres
Anu mimiti, urang kedah ngartos bédana antara prosés transkripsi sabalikna sareng prosés PCR.PCR ngalaman sababaraha prosés pemanasan sarta annealing, sarta fragmen target tumuwuh éksponénsial;bari transkripsi sabalikna teu mibanda prosés ieu, urang bisa ngabayangkeun yén transkripsi sabalikna sabenerna hiji-ka-hiji Salila prosés réplikasi, saloba potongan RNA.
sakumaha aya bisa meunang saloba potongan cDNA Émbaran, éta kudu dipikaharti ku kiwari, sabab fragmen badag sarta leutik geus tibalik-transcribed, sarta mustahil pikeun difokuskeun hiji fragmen.Sarta alatan jumlah RNA relatif leutik, jumlah cDNA diala ogé relatif leutik, teu saperti PCR, nu boga pangaruh amplifikasi, jadi dasarna teu mungkin pikeun ngadeteksi.
hasil éléktroforésis cDNA
Bréh, ideally, transkripsi sabalikna dipigawé hiji-ka-hiji, tapi euweuh transcriptase sabalikna ti sagala parusahaan bisa ngahontal éfék ieu.Dasarna, efisiensi kalolobaan transcriptases ngabalikeun ngumbara antara 30-50%.Upami ieu hal, urang bakal rada boga efisiensi transkripsi sabalikna rélatif stabil, nu urang hoyong ningali dina gambar: 3 RNA meunang 2 cDNAs, 6 RNAs meunang 4 cDNAs, jadi euweuh urusan sabaraha sampel dimuat, efisiensi transkripsi sabalikna relatif stabil.Kami henteu hoyong ningali kaayaan dimana efisiensi transkripsi sabalikna teu stabil sareng konsentrasi luhur dihambat.
Janten, kumaha pariksa naha efisiensi transkripsi sabalikna stabil?Metoda basajan pisan, Anjeun ngan perlu ngalakukeun hiji test ngabandingkeun: hiji ngabalikeun transkripsi kana cDNA sanggeus duka kali éncér RNA, sarta séjén nyaéta pikeun nyieun duka kali éncér sanggeus ngabalikeun transkripsi kana cDNA, lajeng ngalakukeun qPCR ningali lamping diala Dupi éta konsisten.Salaku murid luhur, anjeun kedah ngartos dina sababaraha detik.Saperti ditémbongkeun di handap:
Éncér RNA sareng cDNA pikeun nguji naha éfisién transkripsi sabalikna stabil
Reverse transcriptase sareng kit
Kumaha PCR kuantitatif fluoresensi sampurna gaduh transkripase sareng kit sabalikna anu saé.Reverse transcriptase kasarna dibagi jadi dua jenis nurutkeun sumberna, AMV atawaM-MLV, sareng pagelaranana sami sareng anu dipidangkeun dina tabél.
Aktivitas RNase H
RNase H nyaéta Ribonuclease H, nami Cina nyaéta ribonuclease H, nyaéta éndoribonuklease anu sacara khusus tiasa ngahidrolisis RNA dina ranté hibrida DNA-RNA.RNase H teu bisa ngahidrolisis beungkeut fosfodiester dina DNA untai tunggal atawa untaian ganda atawa RNA, nyaeta, teu bisa nyerna DNA untai tunggal atawa untai ganda atawa RNA.Biasana dianggo dina sintésis untaian kadua cDNA.
Ieu hal aneh.Urang nyebutkeun yén reverse transcriptase boga aktivitas RNase H, teu yen reverse transcriptase ngandung RNase H, sarta eta bisa jadi teu mungkin pikeun misahkeun RNase H tina reverse transcriptase, meureun kusabab konformasi grup tangtu dina reverse transcriptase Aktivitas ieu disababkeun ku reverse transcriptase.
Ku alatan éta, paduli efisiensi transkripsi sabalikna luhur AMV, aktivitas RNase H na ngurangan ngahasilkeun cDNA.Tangtosna, pabrik réagen terus-terusan ngaoptimalkeun produkna pikeun ngaleungitkeun kagiatan RNase H dina transkripase sabalikna saloba mungkin pikeun ningkatkeun ngahasilkeun cDNA.
Suhu anil
Struktur sekundér RNA dina suhu béda
Tempo gambar di luhur pikeun struktur sekundér RNA dina hawa béda, sarta ngagunakeun alat online mFold pikeun nangtukeun struktur sekundér tina sempalan udagan dina suhu husus sarta kaayaan konsentrasi uyah.Dina suhu 55°C, struktur sékundér RNA masih kénéh kompleks, reverse transcriptase teu bisa jalan, jeung struktur sékundér teu bisa direngsekeun sagemblengna nepi ka 65°C, sedengkeun suhu optimum AMV jeung M-MLV jauh leuwih handap tina suhu ieu.
naon anu kedah dilakukeun?Struktur sekundér nyaéta pasangan pelengkap tina citakan sorangan, nu ngabalukarkeun kompetisi kuat antara Primer jeung reverse transcriptase jeung citakan, hasilna runtuyan masalah kayaning low E sarta ulang goréng.
naon anu kedah dilakukeun?Ngan nambahan suhu annealing saloba mungkin.
Seueur pabrik réagen ningkatkeun transkripase balikna ngaliwatan rékayasa genetik.Sababaraha ningkatkeun suhu réaksi, sapertos Jifan sareng Aidelai, sareng sababaraha ngaleungitkeun gugus aktif énzim RNase H pikeun ningkatkeun afinitas antara énzim sareng citakan RNA.Pangirut anu luhur tiasa bersaing sacara kompetitif ngaleungitkeun struktur sekundér sareng maca lancar, sareng ogé ningkatkeun efisiensi transkripsi sabalikna.
Poin konci: transkripsi sabalikna leuwih penting pikeun ngudag konsistensi efisiensi transkripsi sabalikna (énzim teu ngan kudu efisien tapi ogé stabil), tinimbang jumlah sampel dimuat, lamun teu PCR kuantitatif fluoresensi utamana skala badag, éta moal mungkin pisan.Sababaraha cDNAs.
Rupa-rupa pabrik ogé parantos sababaraha usaha dina ngudag konsistensi.Salaku conto, kalolobaan perusahaan ayeuna parantos ngarangkep transkripsi sabalikna salaku kit standar pikeun dijual, anu mangrupikeun pilihan anu saé.
Salaku conto, kit Foregene's RT Easy Series:
RT Easy I (Master premix pikeun kit sintésis cDNA untaian kahiji)
MIQE (5) - informasi gén target
Gambar di luhur ngajelaskeun
1. Naha gén ieu mujarab pikeun percobaan ulang umumna bisa diverifikasi ku percobaan ulang.
2. Gen ID, anjeun terang.
3. Panjang gén, total panjang gén target pasti aya masalah.Nalika ngarancang primers, pastikeun yén panjang amplicon nyaeta antara 80-200bp pikeun mastikeun efisiensi amplifikasi hadé.
4. Sekuen blast informasi ngabandingkeun, gén target perlu dibandingkeun dina bank gene pikeun nyegah Gedekeun non-spésifik.
5. Ayana pseudogenes.Pseudogén nyaéta runtuyan DNA sarupa gén normal tapi leungit fungsi normal na.Ieu sering aya dina kulawarga multi-gen eukariota.Biasana diwakilan ku ψ.Ieu salinan DNA génomik non-fungsi dina génom nu sarupa pisan jeung runtuyan gén coding., umumna henteu ditranskripsi, sareng henteu gaduh harti fisiologis anu jelas.
6. Posisi primer relatif ka exon jeung intron.Dina taun-taun awal, nalika urang ngajawab masalah kontaminasi DNA, urang mindeng nengetan posisi primers, exon, jeung introns, sarta umumna dianggap ngarancang primers sakuliah introns pikeun nyingkahan amplifikasi DNA.Mangga tingali gambar di handap: hideung ngagambarkeun intron, rupa blues ngagambarkeun exon, pink ngagambarkeun primers umum, jeung beureum caang ngagambarkeun primers intron-spanning.
Skema, henteu pernah leres
Naon rencana sampurna ieu sigana, tapi kanyataanna, di hal nu ilahar, primers trans-intron henteu sakumaha gaib sakumaha imagined, sarta maranéhanana ogé bakal ngabalukarkeun Gedekeun non-spésifik.Janten cara anu pangsaéna pikeun nyegah kontaminasi DNA nyaéta ngaleungitkeun DNA lengkep.
7. prediksi konformasi.Ngagunakeun conto ieu deui, make alat online mFold pikeun nangtukeun struktur sekundér tina sempalan target dina suhu husus sarta konsentrasi uyah.
Struktur sekundér RNA dina suhu béda
Struktur sekundér nyaéta pasangan pelengkap témplat sorangan, nu bakal ngakibatkeun kompetisi kuat antara Primer jeung témplat papasangan, sarta kasempetan Primer ngariung nu kirang, hasilna runtuyan masalah kayaning low E sarta ulang goréng.Ngaliwatan prediksi software, lamun euweuh masalah struktur sekundér, éta bakal jadi hébat.Lamun aya, artikel nurutan-up urang husus bakal ngabahas kumaha carana ngajawab masalah ieu.
MIQE (6) -qPCR Oligonucleotides
Pikeun PCR kuantitatif fluoresensi, hal kahiji anu anjeun bajoang unggal dinten nyaéta ékstraksi RNA, sareng anu kadua nyaéta desain primér.
Anu mimiti, urang masih mariksa aturan ngeunaan desain primer numutkeun Daptar pariksa MIQE.Saderhana pisan yén bajingan tiasa seuri, sareng urang tiasa ngarengsekeunana dina hiji kalimat: milari sekuen sareng posisi usik primer sareng metode modifikasi.Pikeun padika purifikasi Primer, sintésis Primer téh jadi murah ayeuna, qPCR pantes PAGE jeung métode purifikasi luhur, sarta informasi alat sintésis teu penting.Seueur jalma anu ngalakukeun primer salami mangpuluh-puluh taun sareng henteu terang yén synthesizer nyaéta ABI3900.
Ngeunaan prinsip-prinsip desain primer, anjeun teu kedah ngapalkeunana ku cara hafalan, sabab kalolobaan software desain primer atanapi alat online tiasa ngatasi masalah-masalah ieu (dianjurkeun alat online primer3.ut.ee/), sareng 99,999% desain primer henteu dilakukeun sacara manual Tingali, panulis kadang ngarancang ratusan buku primer dina sadinten, upami anjeun maca hiji-hiji, éta bakal janten mata silang.
Ngan pariksa titik di handap ieu sanggeus primers dirancang:
1. Desain primers deukeut tungtung 3′: Dina kasus ngagunakeun oligo dT primers pikeun cDNA kahiji-strand sintésis, tempo efisiensi transkripsi sabalikna jeung integritas RNA, primers dirancang kudu dirancang deukeut jeung 3′ tungtung pikeun ngaronjatkeun efisiensi amplifikasi .Anggo gambar pikeun ngajelaskeun sapertos kieu (teu aya cara pikeun ngartos ieu):
Naha kudu primers dirancang deukeut 3 'tungtung, teu kedah leres
2. Nilai TM: Nilai Tm aya dina 55-65 ° C (sabab aktivitas exonuclease paling luhur dina 60 ° C), sarta eusi GC aya dina 40% -60%.
3. BLAST: Pikeun ngahindarkeun amplifikasi non-spésifik génom, Blast kedah dianggo pikeun verifikasi tambahan.
MIQE (7) - prosés qPCR
1. kit qPCR
Numutkeun sarat tina MIQE, urang kedah jelas ngajelaskeun kaayaan réaksi lengkep dina artikel, kaasup konfigurasi tina sistem réaksi PCR, naon kit dipaké, saha produsén, sabaraha badag sistem réaksi, naha metoda ngalelep atawa metoda usik dipaké, setélan program PCR.Supir Samaun pasti bakal mendakan yén salami kit dipilih, inpormasi di luhur dasarna ditangtukeun.
Ayeuna, pabrik sareng produksi kit PCR kuantitatif fluoresensi mangrupikeun téknologi anu dewasa pisan.Salami anjeun henteu milih produsén anu parah pisan, kamungkinan masalah henteu luhur, tapi kami tetep hoyong bagikeun sababaraha poin sareng anjeun:
Enzim Taq mimiti panas:Bagian anu paling penting tina PCR nyaéta énzim Taq mimiti panas.Énzim mimiti panas di pasar umumna dibagi jadi dua jinis, hiji nyaéta énzim mimiti panas anu dirobih sacara kimia (anjeun tiasa ngabayangkeun éta salaku parafin embedding), sareng anu sanésna mangrupikeun énzim mimiti panas pikeun modifikasi antibodi (ngabeungkeut antigen-antibodi).Modifikasi kimiawi mangrupikeun cara awal énzim ngamimitian panas.Lamun suhu nu tangtu geus ngahontal, énzim bakal ngaleupaskeun aktivitas na.Enzim mimiti panas anu dirobih antibodi ngagunakeun metode biologis pikeun meungpeuk kagiatan énzim.Nalika suhu nu tangtu geus ngahontal, antibodi bakal denatured na inactivated salaku protéin, sarta aktivitas énzim bakal dibawa kana antrian.
Nanging, naon gunana ieu?Dina hal ieu, kagiatan sékrési énzim anu dirobih antibodi langkung gancang tibatan énzim anu dirobih sacara kimia, janten tina segi sensitipitas, énzim anu dirobih antibodi gaduh sakedik kauntungan, ku kituna dasarna henteu aya énzim anu dirobih sacara kimia dina kit di pasar.Upami aya, maka téknologi pabrik ieu masih nyangkut dina jaman milénium.
Konsentrasi ion magnésium:Konsentrasi ion magnésium penting pisan dina réaksi PCR.Konsentrasi ion magnésium anu pas tiasa ngamajukeun sékrési kagiatan énzim Taq.Lamun konsentrasi teuing low, aktivitas énzim bakal nyata ngurangan;lamun konsentrasi teuing tinggi, amplifikasi non-spésifik dikatalisis énzim bakal ditingkatkeun.Konsentrasi ion magnésium ogé bakal mangaruhan annealing of primers, suhu lebur tina citakan jeung produk PCR, kukituna mangaruhan ngahasilkeun fragmen amplified.Konsentrasi ion magnésium umumna dikawasa dina 25mM.Tangtu, pikeun kit alus, konsentrasi ion magnésium kudu ogé dikawasa.Sababaraha padagang nambahkeun agén chelating ion magnésium kana réagen, nu bisa ngahontal efek adjustment otomatis tina konsentrasi ion magnésium.
Konsentrasi pewarna fluoresensi:Pewarna fluoresensi, nyaéta SYBR Héjo anu biasa kami anggo, utamina ngahasilkeun fluoresensi ku ngabeungkeut kana alur minor DNA untaian ganda, sabab beungkeutan pewarna kana DNA untaian ganda henteu spésifik, nyaéta salami DNA untaian ganda digabungkeun sareng éta, fluoresensi tiasa kajantenan dina latar tukang, sareng bakal ngabentuk sinyal-sinyal DNA dina latar tukang.
PS: Alatan sipat lampu-sénsitip na, produk di pasar umumna rangkep dina tabung centrifuge opaque coklat (sakumaha ditémbongkeun dina gambar di handap).Sanajan kitu, ieu bakal sapatemon masalah.Hésé ningali naha cairanana disedot nalika sampling.Dina hal ieu, Qingke memang paling ramah-pamaké (sakumaha ditémbongkeun dina gambar di handap), sarta tube transparan ieu rangkep dina kantong tin opaque.Lajeng nempatkeun kana kantong tin, nyokot kana akun genah tina Ngahindarkeun cahaya jeung sampling.Anjeun kedah milih nomer produk anu leres.TSE204 mangrupakeun ayana super ongkos-éféktif, nu ngajadikeun kuring hayang melak jukut.
Konsentrasi pewarna fluoresensi ogé penting pisan.Lamun konsentrasi teuing low, kurva amplifikasi moal naek dina tahap engké na teu sampurna;lamun konsentrasi teuing tinggi, éta bakal ngabalukarkeun gangguan noise.Kusabab PCR kuantitatif fluoresensi utamana gumantung kana nilai CT, lamun konsentrasi ngalelep fluoresensi teu disaluyukeun leres, titik low leuwih hade tinimbang titik luhur.Tangtosna, konsentrasi pewarna anu pas nyaéta anu pangsaéna.
ROX: Pewarna ROX dipaké pikeun ngabenerkeun kasalahan sinyal fluoresensi well-to-well.Sababaraha pabrik alat merlukeun calibration, sedengkeun nu sejenna henteu.Contona, pamakéan alat amplifikasi PCR Real Time Thermo Fisher Scientific biasana merlukeun calibration, kaasup 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, jsb Parentah kit umum bakal ngajelaskeun eta.
Campuran qPCR Foregene ogé ngandung pewarna ROX, anu cocog pikeun dianggo dina sababaraha modél.
Perlakuan beungkeut hidrogén lemah: Pangobatan beungkeut hidrogén lemah nyaéta masalah anu rélatif téknis.Henteu aya anu maca manual seueur kit, tapi teu aya anu nyarioskeun topik ieu.Kanyataanna, éta kacida pentingna.Kombinasi basa utamana gumantung kana kakuatan beungkeut hidrogén.Beungkeut hidrogén kuat nyaéta amplifikasi normal, jeung beungkeut hidrogén lemah ngakibatkeun amplifikasi non-spésifik.Lamun beungkeut hidrogén lemah teu bisa dileungitkeun ogé, amplifikasi non-spésifik teu bisa dihindari.Dina wengkuan pangarang, ngan sababaraha pausahaan geus noticed masalah ieu.Sawaktos Anjeun meuli kit, Anjeun bisa ningali naha anjeun geus dianggap solusi dina hal ieu kit rék milih.
Volume réaksi: Sistim 20-50ul leuwih ilahar dipake, sarta volume leutik kamungkinan ngabalukarkeun kasalahan.Sacara umum, parentah kit bakal nyarankeun pamakéan volume réaksi PCR.Entong pinter sareng nganggo volume anu langkung alit pikeun ngahémat biaya.tujuan tina.Volume dianjurkeun ku padagang sabenerna geus diuji, sarta bisa jadi yén maranéhna moal bisa ngajawab masalah kasalahan disababkeun ku volume leutik.
2. Produsén jeung nomer artikel tina plat tube
Sadayana terang prinsip PCR kuantitatif fluoresensi.Koléksi fluoresensi utamana dilaksanakeun ngaliwatan caps tube PCR.Lamun milih consumables PCR, nengetan dua titik: transmisi cahaya alus tur cocog pikeun alat.Sacara umum, papan sareng tabung merek mainstream henteu kunanaon, tapi anjeun kedah milih sacara saksama dina hal adaptasi, upami henteu, anjeun moal tiasa nganggo alat.
4. Pangaweruh tingkat luhur
MIQE (8) - validasi qPCR
Ieu mangrupikeun prioritas utama qPCR!Janten seueur pahlawan anu murag ka pasir di dieu.Tangtu, eta oge mungkin yen anjeun untung jeung gén nu diajarkeun basajan, jadi Anjeun floated ngaliwatan guha és sapanjang angin.Inpormasi verifikasi qPCR dimaksudkeun pikeun nguji réliabilitas data.Kami daptar inpormasi verifikasi anu diperyogikeun sapertos kieu:
1.Uji spésifik
Spésifisitas amplifikasi gén sasaran diuji ku mariksa naha gambar éléktroforésis mangrupa pita tunggal;verifikasi urutan;kurva lebur ningali lamun peta puncak téh tunggal;verifikasi énzim nyerna jeung métode séjénna.
Di dieu, urang difokuskeun tAnalisis amplifikasi non-spésifik ngagunakeun métode kurva lebur.Sacara umum, nalika urang ngarancang primers, ukuran sempalan produk diwajibkeun dina rentang 80-200bp, nu ngajadikeun suhu lebur produk PCR rentang 80-85 °C.Ku alatan éta, lamun aya rupa-rupa puncak, kudu aya produk amplifikasi non-spésifik séjén;lamun puncak mucunghul handap 80 ° C, éta umumna dianggap dimer primer;lamun puncakna muncul di luhur 85°C, éta umumna dianggap kontaminasi DNA atawa leuwih nonspésifik amplifikasi fragmen badag.
Catetan: Kadang-kadang ngan aya hiji puncak dina 80°C.Dina waktos ieu, konsep ieu kedah dipatuhi.Éta kamungkinan yén hasil amplifikasi sadayana dimer primer.
Kurva lebur normal (puncak tunggal tanpa amplifikasi non-spésifik)
Kurva lebur masalah (amplifikasi non-spésifik tina puncak palsu)
【Analisis Kasus】
Aya puncak utama, tapi dimer Primer serius
Kurva lebur single-puncak dina gambar di handap ieu bisa kalayan gampang nipu panon anjeun, pamikiran eta mangrupakeun percobaan sampurna, tapi hasilna sagemblengna salah.Dina waktu ieu, urang kudu kasampak di suhu lebur.Suhu puncakna sahandapeun 80°C, anu sagemblengna primer-dimer.
Taya fragmen target, sadayana dimer primer
Di dieu, adi kuring teu bisa eureun.Gambar di handap ieu mangrupikeun poto anu dicandak ku telepon sélulér anu dikirimkeun ka kuring ku scumbag.Réagen anu dianggo anjeunna sadayana merek anu biasa dianggo di industri.Anjeunna robah tina hiji merk T-prefix ka merek T-prefix sejen.Jigana anjeun geus nebak eta.Si scumbag ngajerit ka kuring: "Reagen anu dianggo dina gambar kahiji saé teuing, sareng puncakna tunggal.Engké, sanggeus ngagunakeun réagen Anjeun dianjurkeun, éta jadi kawas gambar kadua, kalawan puncak dicampur.Anjeun geus nyieun kuring sangsara.“
Misahkeun dua grafik.Dina glance kahiji, hiji boga puncak tunggal, sarta séjén boga puncak ganda.Omong kosong, hiji puncak tangtu rupa.Naha éta leres?
Parah ti Dou E, lamun kuring nempatkeun dua gambar dina gambar di handap ieu, anjeun bakal ngarti langsung.Kanyataanna, urang gampang lumpuh ku jenis ieu gambar.Saatos analisa ati-ati, urang mendakan yén: puncak inohong kahiji nyaéta dina 75 ° C, anu lengkep dimer primer;puncak inohong kadua némbongan dina 75 ° C jeung 82 ° C, sahenteuna aya Produk mucunghul.
Gambar eupan balik ti siswa
Jadi masalah dasarna lain masalah réagen, tapi masalah desain primer.Dina waktos anu sami, éta ogé ngabuktikeun yén sababaraha merek ageung henteu kualitas beusi, sareng éta ogé ngabuktikeun naon anu ceuk adi kuring sateuacanna: Éta sanés merek réagen anu ngadukung tulisan anjeun.Éta artikel anjeun nu propped up merek réagen.Bayangkeun waé, upami scumbag henteu ngarobih réagen, data anu salah bakal dikirim ka jurnal, sareng naon anu bakal kajadian bakal janten tragedi.
2. nilai Ct kontrol kosong
Tong dijelaskeun, upami kontrol kosong gaduh nilai Ct, sanés polusi?Nanging, anjeun masih kedah ngartos mana kontrol kosong anu gaduh nilai Ct.Upami NTC, berarti aya DNA asing sapertos kontaminasi reagen.Upami éta NRT, éta hartosna RNA anu diekstrak ngagaduhan kontaminasi DNA.
3. kurva baku
Kaasup rumus slope jeung itungan, efisiensi PCR bisa diitung ngaliwatan rumus.Percobaan sampurna merlukeun kemiringan kurva baku pikeun ngadeukeutan 3.32, sarta R² pikeun ngadeukeutan 0.9999.
4. rentang dinamis linier
Rentang dinamis réaksina linier.Numutkeun témplat dipaké pikeun ngahasilkeun kurva baku, rentang dinamis kudu ngawengku sahanteuna 5 gradién konsentrasi, sarta nengetan parobahan nilai Ct dina gradién konsentrasi luhur sarta gradién konsentrasi low.
5. akurasi deteksi
Parobahan dina hasil qPCR, nyaéta, kaulangan goréng, nyaéta, akurasi goréng, disababkeun ku sababaraha faktor, kalebet suhu, konsentrasi, sareng operasi.Katepatan qPCR umumna janten kirang dikontrol nalika jumlah salinan turun.Ideally dina variasi ékspérimén, variasi téknis ieu kudu béda ti variasi biologis, sarta réplika biologis bisa langsung alamat béda statistik dina hasil qPCR antara grup atawa perlakuan.Hususna pikeun tes diagnostik, katepatan antar-assay pangsaéna (kabisaulangan) di sakuliah situs sareng operator kedah dilaporkeun.
6. Efisiensi deteksi sareng LOD (dina multiplex qPCR)
LOD mangrupikeun konsentrasi panghandapna tina 95% sampel positip anu dideteksi.Kalayan kecap sanésna, konsentrasi LOD anu dikandung dina sakumpulan réplikasi gen udagan henteu kedah langkung ti 5% tina réaksi anu gagal.Nalika ngalakukeun analisis qPCR multiplex, hususna keur deteksi simultaneous tina mutations titik atanapi polymorphisms, multiplex qPCR perlu nyadiakeun bukti yén akurasi sababaraha fragmen target teu compromised dina tube sarua, sababaraha deteksi sarta deteksi tube tunggal Efisiensi sarta LOD kedah sami.Utamana nalika gén target konsentrasi luhur sareng gén target konsentrasi rendah sakaligus diamplifikasi, masalah ieu kedah diperhatoskeun.
Masalah sareng solusiSacara umum, masalah anu sering dipendakan dina debugging qPCR fokus kana aspék ieu:
· amplifikasi nonspésifik
· Hese pilihan konsentrasi primer jeung masalah jeung primer-dimer
· Suhu annealing henteu akurat
· Struktur sékundér mangaruhan efisiensi amplifikasi
amplifikasi nonspésifik
amplifikasi non-spésifikkajantenan, umumna dianggap naha desain primer henteu cocog, tapi upami anjeun henteu buru-buru ngarobih primer, anjeun tiasa nyobian metodeu di handap ieu heula (prinsipna ogé napel):
· Ningkatkeun suhu annealing - coba nyieun beungkeut hidrogén lemah teu bisa ngajaga;
·Short annealing na elongation waktos - ngurangan kasempetan beungkeut hidrogén lemah;
· Ngurangan konsentrasi primer - ngurangan kasempetan ngariung primers kaleuleuwihan sarta wewengkon non-target;
efisiensi amplifikasi low
Kaayaan sabalikna mun amplifikasi non-spésifik - efisiensi amplifikasi low, sarta ukuran pikeun nungkulan efisiensi amplifikasi low ngan sabalikna:
· Manjangkeun waktos annealing sareng elongation;
· Robah kana PCR tilu léngkah sareng ngirangan suhu annealing;
· Ningkatkeun konsentrasi primer;
Ps: Seueur mahasiswa pascasarjana dilahirkeun taun 90-an henteu daék diajar kumaha debug ékspérimén, sareng ngarepkeun yén kit tiasa ngabéréskeun masalahna (upami anjeun badé angkat ka perusahaan réagen pikeun ngalakukeun panalungtikan sareng pamekaran saatos kalulusan), kanyataanna, produsén réagen ogé mikirkeun cara ieu, kuring ngarepkeun éta bodo Éta tiasa dianggo nalika anjeun nampi éta, janten réagen réagen parantos nyéépkeun usaha pikeun ngabéréskeun masalah réagen. faktor nyerep beungkeut H lemah.Pikeun gampang ngajawab masalah, fools masih kudu maca bubuka pausahaan réagen pikeun nempo lamun aya faktor nu absorbs beungkeut hidrogén lemah.
Pilihan sesah konsentrasi primer sareng masalah sareng dimer-primer
Métode 1: Sacara umum, parentah kit pikeun qPCR geus dianjurkeun sistem jeung dianjurkeun konsentrasi primer.
Métode 2: Debugging ku netepkeun gradién konsentrasi primer.Gambar di handap ieu dipaling ti perusahaan pikeun ngagambarkeun.Gambar di handap ieu nunjukkeun hasil kuantitatif fluoresensi anu dilakukeun ku tilu gradién konsentrasi primer (100nM, 250nM, 500nM) sareng opat gradién konsentrasi citakan (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Nilai Ct tina hasil ékspérimén digambarkeun saperti kieu:
Pilihan Konsentrasi Primer Gabungkeun unggal konsentrasi primer kana hiji garis saperti kieu:
Pilihan konsentrasi primer jelas, hubungan linier konsentrasi primer 100nM sareng 250nM langkung saé, sareng hubungan linier konsentrasi primer 500nM rélatif goréng.Dina 100nM sareng 250nM, nilai Ct 250nM relatif leutik, janten konsentrasi primer anu optimal nyaéta 250nM.Umumna primer-dimer parna bisa ditempo dina kurva lebur.Kumaha lamun primers dirancang teu bisa nyingkahan primer-dimer?
Métode 3: Ngurangan jumlah primers jeung ningkatkeun suhu annealing (teu perlu ngajelaskeun).
Nilai émpiris suhu anil nyaéta 60 ° C.Upami anjeun henteu yakin, kumaha milih suhu annealing anu langkung cocog?Jawabanana sami sareng pilihan konsentrasi primer -tés gradién.Candak gambar ti parusahaan Bio-rad pikeun ngagambarkeun masalah.Pikeun ngagedékeun sempalan udagan anu tangtu, atur dalapan gradién suhu, masing-masing kalayan tilu pangulangan, sareng kurva amplifikasi anu dicandak nyaéta kieu:
Pilihan suhu annealing:
· 70 ° C, 69 ° C-Dasarna, primers teu bisa digabungkeun, jadi euweuh amplifikasi.
· 67,3 ° C - Aya jumlah leutik amplifikasi di awal, sarta nilai Ct relatif badag.
· 64,5°C——Nilai Ct turun.
· Dina 60,7 ° C, 58,0 ° C, 56,2 ° C, jeung 55,0 ° C, nilai Ct dasarna condong jadi stabil, tapi nilai fluoresensi ahir éta béda.
Kumaha carana milih?Prinsip: Prinsip kahiji nyaeta nilai Ct luhur.Pikeun nilai Ct sarua, pilih suhu annealing luhur pikeun nyegah dimerization jeung Gedekeun non-spésifik.Sanajan aya nilai fluoresensi nu leuwih luhur dina 55 ° C, meureun aya dimer atawa amplifikasi non-spésifik di jerona.
Tapi upami anjeun pinter sapertos anjeun, anjeun pasti bakal mikir: Sacara logis, upami réaksi PCR spésifik pisan, salami konsentrasi primer ngaleuwihan sarat minimum, titik anu luhur sareng anu handap henteu kedah aya pangaruh, sapertos pewarna fluoresensi sareng dNTP.Mémang, salami suhu annealing dioptimalkeun leres, pangaruh konsentrasi primer dina nilai Ct sacara alami bakal minimal.
Suhu annealing dioptimalkeun leres, sareng pangaruh konsentrasi primer dina CT bakal ngaminimalkeun
Struktur sekundér mangaruhan efisiensi amplifikasi
Hayu urang nyandak gambar ti Bio-rad pikeun ngagambarkeun masalah.Éta ogé ngarancang gradién suhu pikeun ngagedékeun gén kalayan struktur sekundér.
Struktur sekundér muncul
Ieu bisa ditempo yén salaku gradién hawa nurun, produk mimiti muncul jeung nilai Ct ngalir ka hareup, ngahontal nilai minimum dina 60,7 ° C, lajeng salaku gradién hawa nurun, nilai Ct jadi leuwih badag.Sabalikna, nalika suhu naék, struktur sekundér dibuka sareng efisiensi amplifikasi ningkat.Saatos ngahontal suhu anu tangtu, ningkatkeun suhu henteu tiasa ningkatkeun efisiensi amplifikasi.Kusabab éta primers teu bisa stably digabungkeun dina waktu ieu.Ku kituna,néangan suhu kalawan nilai Ct panghandapna, nu suhu pangalusna pikeun amplifying template struktur sekundér!Tangtu, fools pinter kudu nyaho yén lamun teu perlu, leuwih sae pikeun ngarobah primers jeung nyingkahan wewengkon struktur sekundér.
5. Tingkat aplikasi
MIQE-Analisis Data
Analisis data utamana dirumuskeun ku instrumen PCR kuantitatif fluoresensi.Dina artikel saméméhna, loba karya analisis data geus dipigawé, kayaning kontrol kosong, nu geus dipedar dina rarancang percobaan.Gén rujukan internal, angka ulangan, jeung sajabana geus dijelaskeun., Di dieu urang utamana ngajelaskeun aplikasi qPCR.
qPCR seueur dianggo, sareng verifikasi ékspérimén sareng diagnosis asam nukléat mangrupikeun skenario anu paling sering dianggo.
kuantifikasi mutlak
Log (konsentrasi awal) miboga hubungan liniér jeung jumlah siklus.Kurva standar tiasa digambar tina standar anu gaduh nomer salinan awal anu dipikanyaho, nyaéta, hubungan linier réaksi amplifikasi tiasa didapet.Numutkeun nilai Ct tina sampel, konsentrasi dina sampel bisa diitung.Jumlah témplat ngawengku.
Métode Itungan Kuantitatif Absolute
Kuantifikasi mutlak kedah dumasar kana kurva standar.Pikeun nyieun kurva baku, standar diperlukeun.Biasana, standar nyaéta plasmid anu dicandak ku cara kloning gén target.Naha éta plasmid a?Kusabab DNA plasmid sirkular paling stabil.Éncér produk baku dina 5 nepi ka 6 gradién nurutkeun rasio duka kali (10-melu éncér), sarta nengetan uniformity nalika éncér.Hayu nilai Ct ragrag antara 15-30.
Persiapan baku
Dina waktos anu sami, sampel anu diuji ogé kedah éncér sasuai (inget faktor éncér), sareng nilai Ct ogé kedah turun antara 15-30.Produk standar + sampel anu bakal diuji dipasang dina mesin babarengan.Sanggeus ngajalankeun, kurva baku dijieun kalawan zat baku, sarta sampel pikeun diuji dibawa kana kurva baku keur ngitung konsentrasi.
Kuantifikasi HBV virus Hépatitis B nyaéta kuantitas mutlak has, nu bisa ngitung jumlah salinan virus dina 1ml getih.
Itungan nomer salinan
Konsentrasi sampel anu diuji (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × faktor éncér
Beurat molekul sampel = jumlah basa × 324
Jumlah salinan sampel anu diuji (salinan/ul) = konsentrasi sampel anu diuji / beurat molekul sampel × 6 × 1014
Métode itungan nomer salinan
Di luhur nyaéta métode itungan pikeun nangtukeun kuantitas.Ieu mangrupikeun masalah matematika anu tiasa direngsekeun saatos lulus SMP, sareng masalah matematika umumna direngsekeun ku komputer.Upami anjeun henteu ngartos, anjeun tiasa sumping pikeun komunikasi.
kuantitas relatif
Kuantifikasi relatif utamana dipaké dina panalungtikan ilmiah.Sabaraha virus anu aya dina 1ml getih, sareng éta virus DNA, ieu mangrupikeun acara anu rélatif deterministik: jumlah getih tiasa ditangtukeun, sareng virus DNA rélatif stabil.Tapi, hese pikeun urang ngabandingkeun jumlah salinan transkripsi gen anu tangtu dina daun, sabab hese nangtukeun ukuran, beurat, sareng kelembutan daun, jumlah RNA anu diekstrak hese ditetepkeun, sareng efisiensi transkripsi sabalikna ogé sesah ditetepkeun, nyaéta, léngkah naon waé tiasa ngajantenkeun data ékspérimén ngagaduhan bug sareng henteu tiasa dianggo.
Ku alatan éta, kuantifikasi relatif kedah ngenalkeun unsur:gén rujukan internal.
Dina basa sejen, kuantifikasi relatif sabenerna ngarupakeun ngabandingkeun antara gén target jeung gén rujukan internal.Dibandingkeun dina jaringan anu sarua jeung sél anu sarua, pangaruh ukuran sampel, jumlah ékstraksi RNA, efisiensi transkripsi sabalikna, sarta efisiensi PCR relatif leutik.Kusabab ukuran sampelna leutik, duanana gén rujukan internal jeung gén target rélatif ngurangan.Ieu sababna kami parantos negeskeun kaseragaman sareng stabilitas sateuacana.
Gén rujukan internal umumnagén housekeeping(gén rumah tangga), nu nujul ka kelas gén nu stably dinyatakeun dina sakabéh sél, sarta produk maranéhanana diperlukeun pikeun ngajaga kagiatan dasar hirup sél.
Tong ngalieurkeun konsép ieu.Gén housekeeping mangrupa istilah fungsi biologis, sedengkeun gén rujukan internal mangrupa istilah teknis eksperimen.Gén housekeeping kedah lulus validasi sateuacan tiasa dipilih salaku gén rujukan internal.
Contona, urang milih sababaraha gén housekeeping dina gambar di handap pikeun nguji tingkat ekspresi maranéhanana dina sél jaringan béda, sarta kapanggih yén tingkat éksprési β-2-microglobulin éta rada béda ti tilu gén lianna, ngarah teu bisa dipaké salaku gén rujukan internal.
Sanggeus ngarti kana fungsi koreksi gén rujukan internal, dua algoritma diturunkeun alatan bubuka gén rujukan internal.
· Métode kurva standar ganda
·2 – △△Metoda Ct (metoda ngabandingkeun nilai CT)
Upami anjeun kabetot dina diajar spésiés sareng fungsi gen, punten nyerah panalungtikan ngeunaan algoritma sareng nganggo rumus langsung, atanapi nganggo mesin langsung;upami anjeun jalma lempeng dina matématika sareng rékayasa, mangga ngarasa gratis.
métode kurva standar ganda
Itung gén udagan jeung gén housekeeping tina sampel kontrol jeung sampel nu bakal diuji ngaliwatan kurva baku, lajeng ngitung nilai relatif nurutkeun rumus itungan, nu tingkat ekspresi relatif.
Kaunggulan: analisis basajan, optimasi eksperimen kawilang basajan
Kakurangan: Pikeun unggal gén, unggal babak percobaan kedah ngadamel kurva standar
Aplikasi: Salah sahiji dua métode kuantitatif relatif paling ilahar dipake tur dipikawanoh dina ulikan régulasi ekspresi gén
Rumusna nyaéta kieu:
Contona nyaéta kieu:
Ngitung jumlah relatif dumasar kana hasil kuantitatif
2 – △△Metoda Ct (metoda ngabandingkeun nilai CT)
Kaunggulan: Teu perlu nyieun kurva baku
kalemahan: Hal ieu dianggap yén efisiensi amplifikasi deukeut 100%;simpangan baku <5%, sarta kurva baku sarta efisiensi antara unggal amplifikasi dianggap konsisten;optimasi kaayaan eksperimen leuwih pajeulit.
Aplikasi: Salah sahiji dua métode kuantitatif relatif paling ilahar dipake tur dipikawanoh dina ulikan régulasi ekspresi gén
Tangtosna, efisiensi amplifikasi biasana teu mungkin sampurna 1. Métode koreksi: Upami urang terang yén gén target sareng gén rujukan gaduh efisiensi amplifikasi anu sami, tapi efisiensi amplifikasi henteu sami sareng 1, maka 2－△△Ct tiasa dilereskeun salaku: (1+E) －△△Ct0.lificationna tiasa dilereskeun, upami rumus Ct0.9 tiasa dibenerkeun, upami rumus Ct,l95 tiasa dibenerkeun. 1,95－△△Ct
Sajauh ieu, eusi ngeunaan PCR kuantitatif fluoresensi parantos réngsé.
waktos pos: Apr-06-2023
